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沉默信息调控因子1通路介导补骨脂酚抑制脂多糖诱导的乳鼠心肌细胞炎症反应及凋亡

2017-09-26秦志刚徐学增谭延振赵达君金振晓易定华

中国体外循环杂志 2017年3期
关键词:毒血症孵育心肌细胞

秦志刚,徐学增,谭延振,赵达君,杨 阳,易 蔚,金振晓,易定华

·基础研究·

沉默信息调控因子1通路介导补骨脂酚抑制脂多糖诱导的乳鼠心肌细胞炎症反应及凋亡

秦志刚,徐学增,谭延振,赵达君,杨 阳,易 蔚,金振晓,易定华

目的研究补骨脂酚(BAK)对脂多糖(LPS)诱导的SD乳鼠心肌细胞炎症反应模型的作用及其分子机制。方法SD乳鼠心肌细胞经1 μM、5 μM或10 μM的BAK孵育4 h后,再用LPS(100 ng/ml)孵育12 h,造成炎性心肌细胞损伤。用CCK8法检测心肌细胞活力,TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平。ELISA法检测培养基中炎性因子TNF-α和IL-1水平,Western-blot法检测SIRT1、Bax和Bcl-2的表达水平。使用沉默信息调控因子1(SIRT1)阻断剂EX527观察SIRT1信号通路在这一过程中的作用。结果LPS处理可以诱导心肌细胞炎性因子肿瘤坏死因子-α和白介素-1释放(P<0.05 vs control组),降低心肌细胞活力并促进其凋亡。蛋白水平抑制SIRT1表达,Bcl2下调,Bax上调(P<0.05 vs control组)。1 μM、5 μM和10 μM的BAK预孵育可浓度依赖性地抑制炎性因子释放、改善心肌细胞活力、上调SIRT1表达,提高Bcl2并降低Bax表达,抑制心肌细胞凋亡。SIRT1阻断剂EX527可显著抑制上述抗炎及抗凋亡作用。结论BAK通过激活SIRT1信号通路,减轻LPS诱导的大鼠心肌细胞炎症反应。

补骨脂酚;心肌炎症损伤;沉默信息调控因子1

脓毒血症是住院患者死亡的重要原因,往往由急性感染引起,伴随着细菌胞壁脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的释放入血,诱导全身炎症反应以及多器官损伤[1]。其中,心脏功能损伤是脓毒血症的典型症状且与死亡率密切相关[2],其主要损伤机制为LPS诱导心肌细胞产生大量炎性因子,募集炎症细胞浸润、损伤心肌组织。研究表明,脓毒血症极易诱导爆发性心肌炎,目前尚无有效的药物治疗办法[3],其发生心脏功能障碍的脓毒血症患者死亡率为70%~90%[4],而不伴有心功能障碍的患者死亡率仅为20%。因此,抑制炎症,保护患者心脏功能成为脓毒血症患者治疗过程中的关键点。

补骨脂酚(bakuchiol,BAK)是豆科植物补骨脂果实中提取的单萜化合物,具有广泛的药理活性。研究表明,BAK具有抗菌活性、抗肿瘤活性、消炎作用、降糖降血脂作用、抗氧化活性、植物雌激素样作用等[5-11]。最新研究发现,BAK在心肌缺血再灌损伤中发挥抗氧化应激及抗心肌凋亡等保护作用[11]。基于以上研究结果,BAK在脓毒血症诱导心肌炎症反应中的作用及机制值得探讨。

1 材料与方法

1.1材料 清洁级SD大鼠仔鼠,1~3 d龄,购自于第四军医大学动物中心,F12/DMEM购自于Hyclone公司,胎牛血清购于Gibco公司,Ⅱ型胶原酶、胰酶、BAK、LPS、二甲基亚砜(DMSO)、SIRT1特异性阻断剂EX527均购自Sigma公司。Ⅱ型胶原酶溶于PBS至终浓度0.1%,胰酶溶于PBS至终浓度0.4%,均使用0.22 μm滤器过滤。BAK及EX527均先溶于DMSO,然后使用生理盐水稀释至给药浓度(DMSO<1%)。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)夹心ELISA试剂盒购自武汉Elabscience公司。TUNEL凋亡检测试剂盒购于德国罗氏公司。CCK8检测试剂盒购于七海生物公司。RIPA裂解液、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒购于碧云天公司。抗沉默信息调控因子1(SIRT1)、Bcl-2和Bax一抗购自CST公司。抗β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自CMCTAG公司,辣根过氧化物酶标记的IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2仪器 二氧化碳细胞培养箱(Thermo公司),倒置相差显微镜(Nikon,Western blot)电泳、转膜及发光成像设备(Bio-Rad公司)。酶标仪(SpectraMax公司),激光共聚焦显微镜(OLYMPUS公司)。

1.3方法

1.3.1大鼠心室肌原代细胞培养 1~3 d龄清洁级SD大鼠仔鼠,浸于75%酒精消毒两次,以肋弓下缘为界,作一T形切口剪开皮肤并向两侧拨开。充分暴露胸廓后,从心尖位置向上纵行剪开骨性胸廓,暴露心脏,用眼科剪剪取心尖部分置于预冷的PBS溶液中,洗涤干净后,将心尖剪碎成1 mm3大小组织块,使用0.4%胰酶与0.1%Ⅱ型胶原酶交替消化至组织块完全消失。使用培养基终止消化,1 000 rpm离心3 min,弃上清后使用含10%胎牛血清的F12/DMEM培养基重悬细胞,差速贴壁120 min。小心吸取上层培养基接种于培养瓶,48 h后即可获得贴壁的大鼠心室肌原代细胞。细胞给药前12 h给予无血清F12/DMEM培养基换液处理。

1.3.2实验分组及CCK8细胞活性检测 为探究BAK在LPS模型中的作用,首先将实验分为5组,分别为对照组、LPS组、BAK(1 μM)+ LPS组、BAK(5 μM)+ LPS组和BAK(10 μM)+LPS组,每组n=8。BAK给药方式为,含不同浓度BAK的无血清F12/DMEM培养基孵育4 h后,弃上清,PBS洗涤后加入含100 ng/ml LPS的无血清培养基孵育12 h建立模型。随后,为观察SIRT1通路在BAK抑制心肌炎症中的作用,将实验分为4组,分别为LPS组、BAK(10 μM)+LPS组、BAK(10 μM)+EX527+ LPS组、EX527+ LPS组,每组n=8。EX527配制方法如前文,用法为在BAK给药前,以10 μM浓度处理2 h,特异性阻断SIRT1通路。各组处理后将培养液弃掉,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞培养板3次,再加入 100 μl DM EM 培养液和10 μl CCK-8检测液,置于37细胞培养箱孵育2 h,用酶标仪检测各孔OD值(450 nm波长下吸光度值),实验重复3次。

1.3.3细胞上清IL-1、TNF-α水平检测 给予LPS 12 h后,收集细胞培养液,1 000 rpm离心3 min后,吸取上清。严格根据操作说明,使用ELISA试剂盒检测炎性因子水平,每个样品设2复孔,每组实验重复8次。

1.3.4TUNEL染色检测细胞凋亡 取细胞共聚焦培养皿,严格按照说明书操作进行染色(绿色荧光),使用DAPI进行细胞核染色(蓝色荧光)。高倍镜下观察荧光,随机选取5个视野计数凋亡细胞核数,计算心肌细胞凋亡率。

1.3.5组织SIRT1通路及凋亡水平变化 收集各组细胞,用PBS清洗后置于冰上,加入RIPA及蛋白酶抑制剂混合物40 μl,充分震荡混匀,冰上裂解20 min,随后以12 000 rpm离心20 min。收集细胞裂解上清,采用BCA法测定蛋白浓度并调整其至一致。然后将其与5x上样缓冲液按照1∶4比例混匀并煮沸10 min。使用10%SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳并用转膜仪转到PVDF膜上。使用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h后分别孵育在SIRT1 (1∶1 000),Bcl-2 (1∶1 000),Bax (1∶1 000),β-actin (1∶3 000)抗体中,4℃过夜。使用TBST洗涤并使用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h。TBST洗涤后,使用Bio-Rad照相系统采集照片,并用ImageLab软件进行条带分析。

2 结 果

2.1BAK对LPS模型炎性因子影响 LPS孵育诱导大鼠心室肌原代细胞炎性因子IL-1、TNF-α释放,培养液中含量明显升高(与control组相比,P<0.05),BAK孵育显著抑制大鼠心室肌原代细胞炎症反应(与LPS组相比,P<0.05),培养液中IL-1、TNF-α含量降低,且降低幅度随着BAK浓度升高而增大,提示BAK抗炎作用与药物剂量呈正相关(P<0.05)。见图1。

注: a与control组比较P<0.05;b与LPS组比较P<0.05;c与BAK 1 μM+LPS组比较P<0.05;d与BAK 5 μM+LPS组比较P<0.05。图1 BAK对LPS模型炎性因子水平的影响

2.2BAK对LPS模型心肌细胞活力及凋亡的影响 LPS显著降低心肌细胞活力(与control组相比,P<0.05),梯度给予BAK后,细胞活力明显恢复(与LPS组相比,P<0.05)。见图2。

LPS可明显诱导心肌细胞凋亡(与control组相比,P<0.05),给予BAK后凋亡比例明显降低(与LPS组相比,P<0.05)。见图3。

注: a与control组比较P<0.05;b与LPS组比较P<0.05;c与BAK 1 μM+LPS组比较P<0.05;d与BAK 5 μM+LPS组比较P<0.05。图2 BAK对LPS模型心肌细胞活力的影响

注: a与control组比较P<0.05;b与LPS组比较P<0.05;c与BAK 10μM+LPS组比较P<0.05;d与BAK 10 μM+ EX527+LPS组比较P<0.05。图3 BAK及阻断剂EX527对LPS模型心肌细胞凋亡的影响

2.2BAK对LPS模型大鼠心肌SIRT1、凋亡相关蛋白水平的影响 LPS组SIRT1 、Bcl-2表达显著下降,而Bax水平明显上升,Bcl-2/Bax比值降低(与对照组相比,P<0.05),其结果提示LPS可诱导心肌细胞促凋亡蛋白的表达升高。给予BAK预处理后,随着BAK给药浓度提高, SIRT1 、Bcl-2表达水平逐渐回升,Bax蛋白表达水平则降低(与LPS组相比,P<0.05),提示BAK激活SIRT1通路,具有抗凋亡作用,且具有剂量依赖性(P<0.05)。Western blot结果见图 4。

2.4EX527处理对BAK抑制LPS诱导的炎性因子水平、提高心肌细胞活性、减少凋亡及SIRT1通路和凋亡相关蛋白表达的影响 给予EX527选择性阻断SIRT1通路后,培养基中炎性因子水平及心肌细胞活性明显升高(与BAK 10 μM+LPS组相比,P<0.05),但低于单纯LPS组及EX527+LPS组(P<0.05),提示SIRT1为BAK发挥抗炎症反应作用的重要蛋白。而单独给予EX527+ LPS并未提高IL-1、TNF-α表达水平及心肌细胞活性(与LPS组相比,P>0.05)。如图3,给予EX527后,心肌凋亡明显增加(BAK 10 μM+LPS组vs BAK 10 μM+EX527+ LPS组,P<0.05),可见阻断SIRT1信号可明显减弱BAK的抗凋亡作用。见图5。

Western blot典型结果如图6 所示,BAK 10 μM+ LPS组与LPS组相比,SIRT1、Bcl-2水平明显升高,Bax蛋白表达下降,Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)。BAK 10 μM+EX527+ LPS组与BAK 10 μM+ LPS组相比,SIRT1及Bcl-2水平表达下调,Bax蛋白呈上调趋势(P<0.05),提示心肌细胞促凋亡蛋白表达增加。EX527+LPS组与LPS组各蛋白指标并无明显差异(P>0.05)。上述结果表明,SIRT1为BAK发挥抗LPS诱导心肌细胞炎性反应和凋亡信号的重要通路。

注: a与control组比较P<0.05;b与LPS组比较P<0.05;c与BAK 1 μM+LPS组比较P<0.05;d与BAK 5 μM+LPS组比较P<0.05。图4 BAK对LPS模型大鼠心肌SIRT1、凋亡相关蛋白水平的影响

注: a与LPS组比较P<0.05;b与BAK 10 μM+LPS组比较P<0.05;c与BAK 10 μM+EX527+LPS组比较P<0.05。图5 EX527处理对BAK抑制LPS诱导的炎性因子水平及心肌细胞活性的影响

注: a与LPS组比较P<0.05;b与BAK 10 μM+LPS组比较P<0.05;c与BAK 10 μM+EX527+LPS组比较P<0.05。图6 EX527处理对BAK抑制SIRT1通路和凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨 论

心功能损伤是脓毒血症患者的常见症状和重要死因,研究表明,脓毒血症可以引起LPS的释放,从而激活TLR4等受体,产生IL-1、TNF-α等大量炎性因子[13],下调Bcl-2和上调Bax,诱导心肌细胞凋亡[14]。氧化应激也是脓毒血症引发心功能损伤的另一重要因素,在脓毒血症的病理过程中,活性氧簇(ROS)促进脂质发生过氧化反应,引起细胞及线粒体膜结构损伤,从而诱导细胞坏死及凋亡。此外,ROS还能改变线粒体内膜势能,使细胞色素C泄露进入细胞质中,激活细胞程序性凋亡通路[15-16]。

BAK具有广泛的药理活性。研究表明,BAK对多种疾病均具有治疗和预防作用[5-11]。以往研究发现,在LPS诱导的巨噬细胞系RAW264.7模型中,BAK可以显著降低其炎性因子表达水平,提示其抗炎作用[17]。在LPS诱导的肺损伤中,BAK亦表现出明显的抗炎、肺组织保护功能[18]。在心肌缺血再灌注损伤中,BAK通过SIRT1信号通路发挥抗氧化应激及抗心肌凋亡等保护作用[12]。

SIRT1是一种位于细胞核的脱乙酰化酶,可作用于下游的多种底物发挥生理效应[19-20],研究表明SIRT1信号通路在心脏缺血再灌注损伤中发挥保护作用且同Bcl-2/Bax凋亡信号通路密切相关[22-24]。本研究发现LPS小鼠模型中,心功能损伤伴随着SIRT1信号通路受损以及Bcl-2/Bax比值增加。BAK可剂量依赖性的激活SIRT1信号通路,改善心功能,降低炎性因子水平,抑制心肌细胞凋亡。

本研究证实,BAK可通过SIRT1保护性信号通路,抑制LPS诱导的心肌炎症反应及心肌细胞凋亡。

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BakuchiolamelioratesLPS-inducedcardiomyocyteinflammationandapoptosisviaSIRT1pathway

Qin Zhi-gang, Xu Xue-zeng, Tan Yan-zhen, Zhao Da-Jun, Yang Yang, Yi Wei, Jin Zhen-xiao,Yi Ding-hua

DepartmentofCardiovascularSurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Shaan'xiXi'an710032,China

YiDing-hua,E-mail:yidh@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate whether BAK exerts an effect on LPS-induced cardiomyocyte inflammation and the mechanisms involved.MethodsNeonatal rat ventricular myocytes (NRVMs) were pretreated with BAK in three dose (1/5/10 μM) for 4 hours and then subjected to LPS stimulation (100 ng/ml, 12 hours). CCK-8 kits were used to measure cell viability.To analyze cardiomyocyte apoptosis, TUNEL assay was performed. ELISA kits were used to measure TNF-α & IL-1 and the expression of SIRT1, Bcl2 and Bax were evaluated by western blotting. The specific inhibitor of SIRT1, EX527 were used to investigate roles of SIRT1 in this process.ResultsLPS administration could induce the release of inflammation factors (TNF-α & IL-1) and LDH1 in neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs). Lower cell viability and more apoptosis were observed. Decreased SIRT1 was observed in LPS-induced inflammation (P<0.05, vs control group). After administration of BAK, as demonstrated by dose-independent decreases of TNF-α & IL-1 and LDH1 cell viability increased while less apoptosis was observed. Western blot analysis showed an upregulation of SIRT1 and Bcl2/Bax ratio. EX527 reversed the anti-inflammatory function of BAK.ConclusionBAK pretreatment may prevent LPS induced inflammation and reduce cardiomyocyte apoptosis via SIRT1 signaling pathway in myocytes.

Bakuchiol;LPS-induced inflammation;Silent information regulation 1

2017-02-14)

2017-04-18)

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.03.13

国家自然科学基金优秀青年项目(81422004);面上项目(81570231、81470480、81670356)

710032西安,第四军医大学第一附属医院心血管外科(秦志刚、徐学增、谭延振、赵达君、易 蔚、金振晓、易定华);210008 南京,南京大学附属鼓楼医院心胸外科(杨 阳)

易定华,E-mail:yidh@fmmu.edu.cn

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