改良穿刺法建立大鼠无血预充非停跳体外循环后认知功能障碍模型

段铭杰，孙莹杰，郑 翔，李思沁，屈鹏霞

·基础研究·

改良穿刺法建立大鼠无血预充非停跳体外循环后认知功能障碍模型

段铭杰，孙莹杰，郑 翔，李思沁，屈鹏霞

目的寻找建立大鼠无血预充非停跳体外循环术后认知功能障碍模型的简便方法。方法SD大鼠 20只，0.2%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉。经由锁骨上入路右上腔静脉穿刺引流，尾动脉穿刺灌注，隐动脉穿刺监测血压。术中持续监测心率、血氧饱和度及肛温。转流流量维持在100 ml/(min·kg)，转流中根据血气结果适当补充葡萄糖酸钙、潘南金(门冬氨酸钾镁注射液)和碳酸氢钠调整血气指标，体外循环转流60 min。结果16只大鼠成功存活，存活大鼠术后一天均可完成水迷宫训练。结论此种改良穿刺方法建立的体外循环模型，创伤小、简便易行，可用于术后行为学检测。

静脉穿刺；认知功能障碍；体外循环；水迷宫

研究表明体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)是诱发术后认知功能障碍(post operative cognitive dysfunction，POCD)的独立危险因素，其发生率可高达40%～60%[1-2]。阐明CPB与POCD发生机制的首要任务是要建立合适的动物模型。本课题组前期建立的大鼠CPB模型需开胸、心脏停跳等复杂手术操作，创伤大、术后恢复时间长，术后实施行为学检测较困难，无法判断CPB后是否发生POCD[3]。而如猪、猴、羊等大型动物实验成本高，实验需要的器材昂贵，为寻求简单易行的CPB模型，本实验在以往经验的基础上对模型进行改进，为CPB及其术后POCD等机制的研究提供可靠实验平台。

1 材料与方法

1.1动物与设备 选取雄性健康成年清洁级SD大鼠20只，体重400～500 g, 由原沈阳军区总医院动物实验科提供。小动物呼吸机(江西省特力麻醉呼吸设备公司, TKR-200C型), 恒流蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司, BT00 -300M型), 大鼠专用膜式氧合器(广东科威医疗器械有限公司)，多功能监测仪(日本光电公司)，一次性静脉套管针(美国BD公司)，水迷宫(欣软公司)，全自动温血仪(美国BIGGER公司)。

1.2实验方法 20只大鼠建立CPB模型，其中2只在建立CPB模型前进行水迷宫训练。

1.2.1水迷宫训练 选取两只大鼠标号1、2，每日上午9点进行水迷宫训练。首次训练将大鼠置于水迷宫中自由游泳2 min，使其充分探索环境，休息2 min后，大鼠面对池壁随机放入水迷宫四个象限，限时1 min寻找平台，找到平台则在平台上休息15 s后放入下个象限，未找到平台则记潜伏期60 s，并置于平台休息15 s后放入下一个训练象限。每天训练4次，共训练4天，记录大鼠运动轨迹和运动数据。待大鼠休息1 d后，建立CPB模型。

1.2.2麻醉与穿刺置管 0.2%戊巴比妥钠溶液50 mg/kg、阿托品30 μg/ kg腹腔注射，待大鼠翻正反射消失后固定、备皮，监测血氧饱和度、心电及肛温。 16 G套管针套管透光法行气管插管, 控制呼吸潮气量10 ml/kg ，频率50次/min，维持呼气末二氧化碳35～45 mm Hg。消毒，铺无菌单。选取右锁骨内1/3向头侧0.5 cm为进针点，1%利多卡因局麻，采用幼儿深静脉穿刺针、进针方向指向剑突，见到回血后导丝倒置置入，扩皮后置入带侧孔18 G套管针。建立静脉通路后给予舒芬太尼3 μg/kg、罗库溴铵1.2 mg/kg。术中根据需要给予维持剂量的舒芬太尼1 μg/kg、罗库溴铵0.4 mg/kg。根据需要微量泵输注琥珀酰明胶(血定安)1 ml/h，备静脉引流用。游离尾动脉远端结扎，向近端穿刺置22 G套管针备用灌注，左下肢游离隐动脉远端结扎，向近端穿刺置24 G套管针监测有创血压。

1.2.3CPB 预充液为20%甘露醇1 ml、5%碳酸氢钠1 ml、肝素钠100 U/kg，乳酸钠林格注射液与血定安1∶1配置至15 ml。储血槽为5 ml注射器并低于大鼠心脏平面30 cm。连接膜肺、滚动泵，预充转机排气，防止气泡灌入大鼠体内。静脉注射肝素 400 U/kg，调整激活凝血时间(ACT)>480 s。膜肺动脉出血口连接尾动脉，储血槽接收颈静脉引流血液。转流开始逐渐加大引流量至 100 ml/(min·kg)，转流中根据血气结果适当补充葡萄糖酸钙、潘南金(门冬氨酸钾镁注射液)和碳酸氢钠调整血气指标，维持K+5.5～6.5 mmol/L、Ca2+1.5～2.5 mmol/L、pH 7.3～7.4、红细胞比容(Hct)> 0.25。去甲肾上腺素泵注维持平均动脉压(MAP) 60～90 mm Hg。CPB 60 min后停机，根据出入量回输CPB血液以补足循环容量后，改为1 ml/h持续输注。按1∶1给予鱼精蛋白对抗肝素。根据大鼠血压调整血管活性药，待大鼠体征平稳后停药、拔出穿刺针套管、缝合，颈静脉穿刺处充分按压止血。CPB过程用全自动温血仪血液加温、CPB开始后至手术结束应用加热灯为大鼠保温，手术过程维持大鼠肛温在35.5～36.5℃之间。

1.2.4术后 待大鼠自主呼吸恢复，间断脱机观察其呼吸情况，吸氧时血氧饱和度可维持在99%～100%并有体动征兆后，将大鼠解绑放入动物饲养箱复温，保留氧饱和度监测，继续观察。间隔5～10 min或出现氧饱和度降低情况时，可适度牵拉大鼠四肢以刺激大鼠正常呼吸。术后2～3 h，麻醉药残余作用减弱并消失，大鼠呼吸趋于稳定后拔除气管导管。继续观察至大鼠自主活动后，自由食水。未进行水迷宫训练大鼠和1号大鼠术后1 d，2号大鼠术后7 d行水迷宫检测。需要注意的是，CPB术后脱离呼吸机至拔除气管导管前，偶见大鼠因手术、插管等刺激生成痰液， 在气管导管内形成痰栓将气管导管堵塞，用套管针针心可将痰栓吸出。

1.3数据采集 大鼠血压、心率、血氧饱和度和肛温每5 min记录一次。分别在隐动脉穿刺后、CPB开始后5 min、30 min，CPB结束时和结束后30 min行血气分析，记录CPB后水迷宫测试结果。

2 结 果

2.1大鼠CPB后生命体征的变化 20只大鼠术后成功存活16只，存活率80%。与CPB前比较，CPB 30 min和停CPB时点的MAP、心率(HR)、氧分压(PO2)明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；Hct在CPB 5 min、CPB 30 min和停CPB三个时点均明显降低(P<0.05)，见表1。存活大鼠中随机取两只1 d后处死，解剖后可见静脉穿刺处按压止血效果确切，详见图1a-c所示。

2.2大鼠CPB后水迷宫检测结果 14只未训练大鼠CPB后1 d均可在水迷宫中游泳1 min，休息15 s，完成循环四次的强度训练，运动轨迹见图2a-d。1号、2号大鼠术前可迅速找到平台位置，训练轨迹见图3。1号大鼠CPB术后1 d和2号大鼠术后7 d均可找到平台，但1号鼠术后1 d总时间、平均速度、爬上物体时间较术前均延长，四个象限平均速度降低明显。与1号大鼠术后1 d相比，2号大鼠术后7 d的总时间、爬上物体时间和总路程明显延长，而平均速度有所提高，每个象限平均速度的降低程度减少，运动轨迹见图4，运动数据见表2。

表1 CPB前后生命体征及血气分析的变化

注：与CPB前比较，*P<0.05；PCO2:二氧化碳分压；TEM:肛温。

注:1a：皮下可见穿刺出血点，周围组织无血染；1b：剥离浅筋膜及浅层肌肉，可见穿刺出血点，周围无血染；1c：剥离深层肌肉，可见陈旧出血。图1 CPB后静脉穿刺的解剖示意图

大鼠信息总路程(mm)总时间(s)平均速度(mm/s)静止时间(s)潜伏期(s)接近时间(s)爬上物体时间(s)1号术前1443.714.95291.780.004.953.090.86990.083.45286.900.253.453.121.382219.878.03276.380.008.035.311.171053.024.27246.550.254.273.122.031号术后1d2766.485.22230.490.005.224.051.083062.4412.01255.030.2513.957.801.851229.435.13239.800.2511.134.072.122077.949.96208.711.009.967.142.842号术后7d6350.3319.37327.780.0019.379.321.068869.5429.41301.570.0033.0516.631.818302.8133.93244.710.2535.4915.363.154466.9414.91299.650.0021.3813.773.20

注:红色为起点，蓝色为终点，绿色实线为运动轨迹，黄色圆形区域为平台图2 CPB前未训练大鼠术后1 d水迷宫的运动轨迹

图3 1、2号大鼠术前水迷宫运动轨迹

注:4a、4b、4c、4d为1号大鼠术后1 d运动轨迹，4e、4f、4g、4h为2号大鼠术后7 d运动轨迹。图4 术后1 d和7 d水迷宫测试运动轨迹

3 讨 论

良好的CPB动物模型是模拟、研究临床CPB过程必不可少的工具。灌注和引流血液通路是建立CPB动物模型所必须的步骤。本实验采用的是右侧锁骨上入路，盲探右颈静脉穿刺置管的方法，可避开大鼠右颈静脉跨过锁骨和绕行第一肋的两次转弯，最大程度简化了手术操作、降低手术难度。由于大鼠分别有左右两条上腔静脉汇入右心房，不同于人体解剖结构特点，本方法不需要结扎右侧颈静脉，故不会引起对侧腔静脉血液回流的代偿，降低血供和回流障碍而对颅脑产生影响，这种改良穿刺建立的模型对中枢神经系统尤其是脑功能的研究有重要意义。此种置管引流方法可减少颈部肌肉损伤，既保护了大鼠术后运动能力，也减轻了由于手术刺激引起机体反应，为单纯进行CPB研究减少了混杂因素。

从术后康复角度来说，本实验建立的CPB模型没有选择开胸的方式，大鼠术后能够迅速恢复。本实验选择股动脉向下延续分支的隐动脉作为有创动脉压监测血管，可大大减少下肢缺血区域，同样提高了大鼠术后恢复速度。尾动脉较隐动脉粗大，可置入22 G套管针，作为灌注血管可获得更大灌注速度。在穿刺操作时，套管针进入尾动脉非暴露段后推送套管时的阻尼感可以帮助判断套管是否在动脉内。

本实验通过上述改良穿刺法，成功建立了大鼠CPB模型，存活率80%。CPB期间大鼠血压、平均动脉压、心率、动脉氧分压明显降低，通过调整血管活性药、引流量及转流速度将以上指标维持在大鼠可以耐受范围。术后30 min，大鼠血流动力学指标较体外循环结束时明显好转。Hct经过预充液稀释明显降低，体外循环时继续补充离子和液体使Hct在CPB结束时降到最低约30%左右，术后30 min通过排尿和回输自体血，使得Hct有所回升。

大鼠血容量为70 ml/kg，由于体重较小，预充液对大鼠血液直接稀释作用在转流开始便可体现，因此，减少整个手术过程失血和降低预充液的稀释作用对大鼠体液系统的影响成为模型建立成功的关键。将液体管道用医用延长管和输血器进行改进，使管道和膜肺中的预充液在10～11 ml之间，以求预充液最小用量。配置15 ml剩余的预充液可以在CPB过程中适当补液用。成年大鼠平均心排血量为160 ～ 180 m l /(kg·min)[3],以往建立大鼠CPB模型的文献报道中[4-7]，CPB过程中对于引流和灌注速度选择也不尽相同，因此，本实验选择将引流灌注量保持在100 ml/(min·kg)，并根据大鼠血压、血氧饱和度和血气指标适当调节。大鼠呼吸频率和心率较快，体温、血压和血气生理指标与人类似[8]，在CPB过程中，K+、Ca2+等离子根据血气指标调节在正常范围内。手术过程中通过对气体、血管活性药物、液体等方面细致严格计算和输入才能使大鼠得以良好存活。

本实验共死亡大鼠4只，其中2只在转流开始后几分钟内引流量骤减，血压下降，随后死亡。将其解剖后发现导管尖端穿破心房壁导致心包充血压塞，致大鼠死亡。为防止这种事故发生，在置入导丝、导管或调整导管位置时尽可能轻柔，耐心体会导丝和导管在血管中移动的感觉，遇到阻力不可强行推进，适当退出导丝或导管，调整大鼠右上肢位置进行辅助。另外两只由于颈静脉穿刺时没能准确刺入血管，调整时刺破胸膜，可有明显突破感后回抽见大量气体，穿刺置管失败后解剖发现大鼠血胸形成。熟悉解剖结构，谨慎操作、穿刺熟练的情况下，可以减少这种情况发生。且静脉穿刺创伤小，免去了切皮、游离静脉、缝合等繁琐的手术操作步骤，缩短了手术时间，方便可行。

为检验这种方法建立的大鼠CPB模型是否适合术后行为学检测，分别在术前和术后1 d、7 d进行水迷宫训练测试。术前未经水迷宫训练12只存活大鼠，因对水迷宫环境陌生，可以认为首次训练强度最大，大鼠术后1 d全部完成训练。因此这种改良穿刺方法建立的大鼠CPB模型，在大鼠CPB后检测动物行为学改变是可行的。术前进行水迷宫训练的两只大鼠也分别在1 d、7 d完成水迷宫检测。结果显示，1号鼠术后1 d总时间、平均速度、爬上物体时间较术前延长，四个象限平均速度降低明显，1号大鼠较2号大鼠游泳距离短，对逃生平台定位更准确。提示CPB对大鼠认知功能可能产生影响，但是，由于样本数目过少，两只大鼠运动数据无法做统计学分析，因此尚不能准确判断两只大鼠是否出现POCD，以及造成两只大鼠术前、术后和两只大鼠之间差异的原因。

总之，实验研究目的不同，对模型有不同要求，大鼠CPB模型建立方法有很多种[9-10]。本实验选择大鼠为实验动物，品系纯，个体差异小，虽然手术操作要求高，但大鼠比大型动物实验成本低、操作方便。此种改良穿刺方法建立的CPB模型，创伤小，可缩短手术操作时间、降低手术难度，简便易行，为研究CPB后POCD机制研究提供良好的实验平台。

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Establishmentofrats'cardiopulmonarybypassPOCDmodelbymelioratedpuncturemethod

Duan Ming-jie, Sun Ying-jie, Zheng Xiang, Li Si-qin, Qu Peng-xia

DepartmentofAnaesthesiology,GeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang110016,China

SunYing-jie,Email:sunyingjie9@hotmail.com

ObjectiveTo explore a convenient method of cardiopulmonary bypass POCD model in rats.MethodsTwenty Sprague Dawley rats were anesthetized with Pelltobarbitalum Natricum i.p. Right upper vena cava was punctured for the drainage of blood and caudal artery for perfusion. Heart rate, anal temperature and blood oxygen saturation were monitored. Meanwhile, the blood gas indexes were measured and adjusted during the operation. The flow of CPB was maintained 100 ml/(min·kg)and time interval of CPB lasted for 60 mins.Results16 models were established successfully and all of which were able to complete the water maze training the day after operation.ConclusionThe CPB model established by the improved puncture method can shorten the operation time and reduce the difficulty of operation with more convenience and less trauma.

Vein puncture; Pocd; Cardiopulmonary bypass; Water maze

2017-03-09)

2017-05-05)

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.03.14

国家自然科学基金资助项目(81471121)

10016 沈阳，原沈阳军区总医院麻醉科[段铭杰(研究生)、孙莹杰、郑翔(研究生)、李思沁(研究生)、曲鹏霞(研究生)]；250014 济南，山东省千佛山医院(段铭杰)

孙莹杰，Email：sunyingjie9@hotmail.com