猪流行性腹泻病毒陕西渭南株的遗传变异

吴萌萌，许夏澎，张彦明，周宏超，郭抗抗(西北农林科技大学 动物医学院,陕西杨凌 712100)

猪流行性腹泻病毒陕西渭南株的遗传变异

吴萌萌，许夏澎，张彦明，周宏超，郭抗抗
(西北农林科技大学 动物医学院,陕西杨凌 712100)

从陕西省渭南某规模化猪场采集疑似猪流行性腹泻(PED)仔猪病料进行病毒检测，旨在从基因遗传变异方面分析疾病发生的可能原因。通过RT-PCR从疑似仔猪20份小肠样品中检测到9份PED病毒阳性样品，并扩增出PED病毒M、 ORF3和S基因的部分序列。序列分析结果表明，与CV777疫苗株对比，样品渭南(WN)株PEDVM基因高度保守，同源性为98.2%； ORF3基因存在11处碱基突变，同源性为98.2%；S基因突变较大，存在4个插入区域，分别是164～166、177～179、181～186和416～418 nt，内分核心中和表位区(COE，499～638位氨基酸)存在9个氨基酸突变位点。遗传分析显示，WN株M基因与中国近期分离毒株亲缘关系较近； ORF3基因与同处在G1群中的中国毒株亲缘关系较近，而与CV777疫苗株亲缘关系较远；S基因与中国早期分离毒株及CV777疫苗株亲缘性较远，与当前的流行株亲缘关系密切。这些结果表明，WN株与CV777疫苗株相比，有明显的遗传变异倾向，可能导致目前PEDV疫苗免疫效果下降，PED疫情大规模流行。

猪流行性腹泻病毒；基因克隆；序列分析；遗传变异

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的猪的一种急性、高度接触性肠道传染病，临床表现为水样腹泻、体温升高、呕吐、脱水等[1-2]。本病多发于冬末春初和气候多变的寒冷季节，初生哺乳仔猪最为易感，传播快，治疗不及时的致死率可达100%，给养猪业造成极大的经济损失[3]。疫苗免疫是防控 PED 疫情的重要手段，但2011年以来，可能由于大量PEDV变异株的存在导致疫苗免疫效果普遍下降，造成 PED疫情在国内大规模流行[4-5]。

PEDV为有囊膜的单股线状正链RNA病毒，属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，基因组全长约 28 kb，至少存在 7 个开放阅读框(ORF)，编码 4 种结构蛋白，纤突蛋白S(Spike, S)、小膜蛋白(Small membrane，E)、膜糖蛋白M(Membrane，M)和核衣壳蛋白N(Nucleocapsid，N)，以及 3 种非结构蛋白(复制酶多聚蛋白Pol(1a/1b)和ORF3蛋白)[6]。M基因是 PEDV 的保守基因，编码的 M蛋白结构较为稳定，在病毒粒子的组装和出芽过程中发挥重要作用，并可介导机体产生干扰素[7]。研究已证实， ORF3 基因编码一种活化的钾离子通道蛋白，参与病毒复制，能够调节病毒量及病毒粒子的释放，可能与 PEDV 的致病机理有关[8]。S蛋白是病毒粒子表面的囊膜蛋白，具有抗原性，是PEDV基因工程疫苗和诊断技术等研究中最重要的一个靶蛋白[9-10]。S 蛋白由1 383 个氨基酸组成，分为 S1区(1～789 位氨基酸)和 S2 区(790～1 383 位氨基酸)，S1区位于病毒表面，易产生突变，内含主要的暴露性中和表位和受体结合域，内分核心中和表位区(COE，499～638 aa)能够刺激机体产生特异性的中和抗体，在病毒中和中发挥重要作用，S2区跨膜结构位于病毒粒子内部，多为隐蔽性表位，突变概率较小，几乎不能刺激机体产生抗体，在病毒与宿主细胞融合中发挥重要作用，并决定病毒的组织嗜性和对细胞的侵染能力[11-12]。S基因作为病毒多样性的标志，其突变可能导致病毒抗原性的改变，因此，关于S基因的研究对于判断 PEDV的遗传变异及疫苗免疫效果评价具有重要意义。

本研究通过对陕西渭南某规模化猪场腹泻仔猪病料进行PEDVM基因的RT-PCR检测，确认患猪感染PEDV，进一步对PEDV渭南分离株S基因部分序列、 ORF3基因、M基因进行序列和遗传变异及抗原位点变化分析，为更好的监测PEDV流行情况及PED疫情的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病 料

仔猪小肠及内容物来自陕西渭南地区某规模化养猪场20头1～7日龄腹泻死亡仔猪。无菌采集腹泻仔猪的小肠及肠内容物，放置冰盒中，在4 h 内送至实验室检测。

1.2 主要材料

限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ与TaqDNA聚合酶及PCR试剂购自TaKaRa(大连)公司；DNA Marker DL5000购自Transgen公司；反转录试剂盒购自唯赞公司；快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)购自百泰克公司。

1.3 引物合成

参照GenBank公布的PEDV标准株CV777的全基因序列(GenBank登录号：AF353511)，采用Primer 5.0软件设计扩增PEDV ORF3、M、S基因部分序列的引物(表1)。

表1 引物及扩增产物信息Table 1 Information of primers and amplified products

1.4 病毒RNA的提取

取500 mg的小肠组织及其内容物反复冻融3次，加入1 mL的生理盐水于匀浆器中充分研磨，6 000 r/min离心15 min，取200 μL上清，按照Trizol Reagent说明书提取病毒RNA，提取的RNA -80 ℃保存，备用。

1.5 RT-PCR扩增

以提取的病毒基因组RNA为模板，按照试剂盒说明书进行反转录获得cDNA。体系为：RNA模板2 μL，5×RT SuperMix 2 μL，RNase free ddH2O补至10 μL。反应程序：25 ℃ 10 min，50 ℃ 35 min，85 ℃ 5 min。反应完成后可立即进行PCR。PCR反应体系为：PCR Mixture 10 μL；灭菌蒸馏水7 μL；引物PEDV-M-F 1 μL；PEDV-M-R 1 μL；cDNA 1 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物检测为阳性的样品进行 ORF3和 S1基因片段的RT-PCR扩增。

1.6 序列测定与分析

将M、 ORF3和S基因部分序列的PCR产物进行核酸凝胶电泳，将回收纯化的目的DNA和载体pMD18-T连接，鉴定后进行序列测定。利用BLAST功能对所测得的M、 ORF3和S基因部分序列的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与GenBank已收录的31株国内外PEDV毒株的相应序列进行比对分析，并使用MEGA 5.10构建遗传进化树。

2 结果与分析

2.1病料PEDVM、ORF3和S基因部分序列RT-PCR

以RNA 为模板，利用引物PEDV-M-F和PEDV-M-R，对20份病料进行PEDVM基因的RT-PCR检测，共检测出9份阳性病料，检出率为45%。电泳结果可见与预期大小750 bp一致的特异性条带(图1)。以RNA 为模板，利用引物PEDV-ORF3-F、PEDV-ORF3-R、PEDV-S1-F、PEDV-S2-R对阳性病料进行 ORF3和S基因部分序列的RT-PCR扩增(图2，图3)。

M.DNA marker DL5000；1～9.PEDV阳性病料PCR产物 PEDV gene PCR products;10.阴性对照 Negative control

图1PEDV阳性病料RT-PCR扩增
Fig.1RT-PCRofPEDVpositivesamples

M.DNA marker DL5000 ;1.S基因PCR产物Sgene PCR product;2.阴性对照 Negative control

图2S基因PCR扩增
Fig.2RT-PCRofSgene

M.DNA marker DL5000;1. ORF3基因PCR产物 ORF3 gene PCR products;2.阴性对照 Negative control

图3ORF3基因扩增
Fig.3RT-PCRofORF3gene

2.2 PEDV分离株S基因部分序列分析

将检测的阳性样品命名为渭南(WN)株，与CV777疫苗株S基因序列比对，WN株存在多个突变位点，出现4个插入区域，164～166、177～179、181～186和416～418 nt，与中国近期分离毒株基因序列差异很小，而且在160～190 nt存在相同的变异情况(图4)。氨基酸序列比对分析显示，WN株S蛋白CEO区域存在9个氨基酸位点突变(图5)。核苷酸同源性分析显示，WN株与CV777疫苗株的同源性为91.2%，与中国近期流行株CH/KF/11和 BJ-2011-2的同源性较高，分别为99.3%和99.2%，与早期流行株CH/S同源性最低，为90.2%。氨基酸序列同源性分析显示，WN株与CV777疫苗株同源性为89.4%，与近期流行株同源性为98.2%～98.9%，与中国早期分离株CH/S(1986年)、ZJCZ4(2004年)同源性较低，分别为88.9%和87.6%。

2.3PEDV分离株S基因部分序列遗传进化树分析

遗传进化树表明，G1分支主要集中包含WN株和中国2011-2012年近期分离毒株属G1分支， CV777疫苗株、3株中国早期分离毒株和Attenuated DR13韩国弱毒疫苗株属G2分支。分离株与CV777疫苗株及中国早期分离株亲缘关系较远，与2011-2012年的近期分离株亲缘关系密切(图6)。

WN.渭南株 WNstrain；CV777.CV777疫苗株 CV777 vaccine strain；其余为国内外分离株 The others mean isolated strains home and abroad;下同 The same as below

图4PEDVWN株和其他毒株S基因的主要缺失和插入位点
Fig.4ThedeletionandinsertioninSgeneofPEDVMNandotherstrains

2.4PEDV分离株ORF3基因序列及遗传进化树分析

与CV777疫苗株比对，分离株 ORF3基因存在11处突变位点(25:T→C；54：G→A；64：C→T 162:T→C；171: T→G； 237:C→T 369: T→C； 439: C→T；537: T→C；；579:T→G；627:C→T)。分离株与CV777疫苗株同源性相对较低，为98.2%，与2011年后中国分离毒株同源性为99%以上。

图5 PEDV WN株和其他毒株S蛋白氨基酸序列的主要缺失和插入位点Fig.5 The deletion and insertion in S amino acids of PEDV WN and other strains

图6 PEDV S基因核酸序列进化树分析Fig.6 Phylogenetic analysis of full-length S gene of PEDV

遗传进化树表明，分离株与同处在G1分支的CV777疫苗株和23支中国毒株亲缘关系较近，与处在G2分支的中国早期分离株毒株和韩国疫苗株Attenuated DRI3的亲缘性较远(图7)。

2.5PEDV分离株M基因序列及遗传进化树分析

与CV777疫苗株序列比对发现WN株M基因存在8处碱基突变(37:G→C；127:T→C；180:A→G；222:C→T；285:T→C；348:T→A；603:A→G；618:T→C)，与CV777疫苗株的同源性98.2%，与同在GI分支的中国分离株GDYA、GDFS120 、GDST1 GDYE67、GDZQ120 HB/BD HB/GY、GDYED、JDYB、HB/LB及美国毒株MN同源性均为99%以上，与G2中的其他中国分离株的同源性为97.7%～98.5%。

WN株，2010-2012年中国近期分离毒株及2003-2007年韩国毒株处于GI分支， CV777及中国早期分离毒株处于G2分支。WN株与同在G1分支的2010-2012年中国近期分离株分离亲缘关系较近，与CV777疫苗株及中国早期分离毒株关系较远(图8)。

▲.渭南株 WN strain； ■.中国分离株 Chinese isolated strains；其余为国外分离株 The others mean foreign isolated strains;下同 The same below

图7PEDVORF3基因核酸序列进化树分析
Fig.7Phylogeneticanalysisoffull-lengthORF3geneofPEDV

3 讨 论

近年来的研究[13]显示，目前仔猪病毒性腹泻多是由PEDV引起的，给养猪业造成严重的危害。PED疫情在中国的出现，最早可追溯到20世纪70年代，1995年，哈尔滨兽药研究所研制出猪流行性腹泻和传染性胃肠炎二联苗，使PED疫情得到暂时有效的控制[14]。但2011年以来，PEDV在中国又呈现大规模流行趋势，造成极大的经济损失，对于PED疫情的防控造成极大的挑战[15]。通过对PEDV相关基因的序列及遗传变异分析，可以为疾病的防控和疫苗的选用提供科学依据。

本研究中，PEDV WN株M基因序列与CV777疫苗株的同源性为98.2%，与中国近期中国分离株的同源性为97.7%～98.5%，与32株国内外参考株同源性比较，同源性均在97%以上，说明PEDVM基因高度保守。 ORF3基因与CV777疫苗株同源性相对较低，为98.2%，与2010年后中国分离毒株同源性为99%以上，而且与国内其它毒株存在相似的突变位点，是否这些突变影响PEDV复制及其毒力，导致PEDV目前的大规模流行还有待研究。S蛋白作为PEDV表面的囊膜蛋白，首先被机体免疫系统识别，随后机体产生针对S蛋白中和表位的抗体[16]。S蛋白的COE区域有B细胞表位，参与B细胞识别及中和抗体产生，有研究[17-18]证实，针对COE区域的抗血清可以阻止宿主细胞被PEDV感染。S基因发生突变有可能导致COE区域抗原性的改变，从而导致S蛋白功能变化，造成疫苗保护力下降，致使PED疫苗免疫猪仍然爆发PED疫情的现象，所以进行S基因的序列分析对于研究PEDV的变异及评估疫苗免疫效果的有效性具有重要意义。本研究通过渭南株与CV777疫苗株及其他国内外流行株的核苷酸和氨基酸序列差异比较，发现绝大多数中国近期分离株同源性极高，并且与CV777疫苗株相比发生明显且相似的变异，表明中国目前PEDV流行株与CV777疫苗株相比，有明显且稳定的遗传变异现象，推测目前中国的PEDV流行株可能来源于相同的毒株，并且具有强毒力，引起目前 PED疫情的大规模流行和疫苗免疫效果的普遍下降。所以有必要进行更多关于PEDV毒株基因变异与现有疫苗保护力的探究，为PEDV的遗传变异情况以及新疫苗的选择提供更多的科学依据。

图8 PEDV M基因核酸序列进化树分析Fig.8 Phylogenetic analysis of full-length M gene of PEDV

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GeneticVariationAnalysisofPorcineEpidemicDiarrheaVirusofWNStraininShaanxiProvince

WU Mengmeng, XU Xiapeng, ZHANG Yanming, ZHOU Hongchao and GUO Kangkang
(College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

Suspected piglet samples of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection were collected from one large-scale swine farms in Weinan, Shaanxi province, and then the possible reason for the occurence of PED in vaccine immune swine farm was detected by genetic variation analysis. It showed that nine positive PEDV samples were detected in 20 intestinal contents samples from suspected piglet by the method of RT-PCR. And then the sequence of theMgene, ORF3 gene, and partialSgene of PEDV were amplified from the positive samples. Sequence analysis shows that M gene of PEDV in WN strain is relatively conserved, sharing 98.2% nucleotide sequence homology with the CV777 strain;11 nt mutations were detected in the ORF3 gene, which sharing 98.2% nucleotide sequence homology with the CV777 strain; the S gene in WN strain is variable with 4 insertions regions, including 164-166 nt,177-179 nt,81-186 nt and 416-418 nt, and 9 aa mutations in COE(499-638 aa) region, which contains the epitope regions inducing the production of neutralizing antibodies for PEDV. Genetic analysis shows that theMgene in WN strain keeps a closer relationship with the isolated strains in China recently than other isolated strains; the ORF3 gene keeps a closer relationship with the isolated strains of China in G1 than the CV777 strain in G2; theSgene has a closer relationship with the epidemic isolated strains recently than the CV777 strain and the isolated strains in China early times. It shows that obvious genetic variation has been occurred in WN strain of PEDV, which may be responsible for the poor immunity protection of vaccines for PEDV and the large-scale spread of PED in swine farms currently.

PEDV(Porcine epidemic diarrhea virus); Gene cloning; Sequence analysis; Genetic variation

2016-06-12

2016-08-06

Agriculture Science and Technology Promotion and Demonstration Project in Shannxi Province (No.ZDKJ2014-33)；Shannxi Science and Technology Innovation Project Plan(No.2014KTCQ02-02).

WU Mengmeng, female,master student. Research area:pathogenic mechainsm of virus disease. E-mail:656820485@qq.com

S852.65+9.6

A

1004-1389(2017)09-1273-08

(责任编辑：顾玉兰Responsibleeditor:GUYulan)

日期：2017-09-12

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170912.1740.004.html

2016-06-12

2016-08-06

陕西省重点农业科技推广及示范项目(ZDKJ2014-33)；陕西省科技统筹创新工程计划(2014KTCQ02-02)。

吴萌萌，女，硕士研究生，研究方向为动物病毒病致病机理。E-mail:656820485@qq.com

张彦明，男，博士生导师，教授，研究方向为动物病原学和兽医公共卫生。E-mail:zhangym@nwsuaf.edu.cn 郭抗抗，男，硕士生导师，副教授，研究方向为动物病原学和兽医公共卫生。E-mail:Guokk2007@nwsuaf.edu.cn

CorrespondingauthorZHANG Yanming ,male, doctoral supervisor,professor.Research area:animal etiology and veterinary public health. E-mail:zhangym@nwsuaf.edu.cn

GUO Kangkang , male, master supervisor,asociate professor.Research area:animal etiology and veterinary public health. E-mail:Guokk2007@nwsuaf.edu.cn