miRNA-93在急性淋巴细胞白血病中的表达

张关亭， 王保蜂

(河南省中医药研究院附属医院检验科， 河南 郑州 450004)

miRNA-93在急性淋巴细胞白血病中的表达

张关亭△， 王保蜂

(河南省中医药研究院附属医院检验科， 河南 郑州 450004)

目的： 探讨微小RNA(miRNA)-93在急性淋巴细胞白血病中的表达情况及其对急性 T 细胞白血病细胞株Jurkat增殖的影响和潜在作用机制。方法: Real-time PCR技术检测急性白血病患者骨髓样本中miRNA-93的表达水平。转染miRNA-93 inhibitor下调Jurkat细胞中miRNA-93的表达，分别采用CCK-8法、EdU法和流式细胞术检测细胞活力、增殖及周期，Western blot检测周期相关调控因子cyclin D1、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、p-Rb及P27的蛋白表达水平。结果: miRNA-93在急性白血病患者中呈现高表达，且在高危患者中表达水平最高；沉默miRNA-93后，Jurkat细胞的活力下降并出现明显的G1/S期阻滞，同时细胞中cyclin D1、CDK4、p-Rb的蛋白水平显著降低，而P27的蛋白水平显著升高。结论: miRNA-93在急性淋巴细胞白血病中表达显著升高；沉默miRNA-93可通过调控周期相关因子的表达抑制急性 T 细胞白血病细胞株Jurkat的增殖。

微小RNA-93; 急性淋巴细胞白血病; 细胞增殖

急性白血病(acute leukemia，AL)是血液系统的常见恶性肿瘤，是由于造血干细胞恶性克隆，骨髓中原始、幼稚细胞异常增殖从而抑制正常造血，严重威胁了人类的生命健康。按FAB分型系统分类，AL可分为急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)和急性非淋巴细胞白血病(acute nonlymphocytic leukemia，ANLL)2大类。其中，ANLL常发生于成年人，而儿童以ALL多见。有研究[1-2]发现，一些微小RNA(microRNA，miRNA，miR)在急性白血病和正常人之间存在表达谱的差异。此外， Mi等[3]报道，有27个miRNA在ANLL与ALL间表达有明显差异，比如Let-7b和miR-223在ANLL中明显上调，而miR-128a和miR-128b则在ALL中则明显高表达，利用这些差异区分ANLL与ALL的准确率在95%以上。这为我们诊断AL提供了新的思路和方法。

miRNA-93是miRNA-106b～25基因簇的一种，其编码基因位于常染色体7q22.1。研究显示，miRNA-106b～25基因簇作为miRNA-17～92家族的同源物，在体内有致癌作用，如在头颈鳞癌、结直肠癌、胃癌及肝癌等肿瘤组织中均可检测到该家族成员的高表达[4-7]。然而该家族中每一个miRNA在不同肿瘤中的确切作用不尽相同，Li等[8]研究提示，miRNA-93可通过调控PI3K/Akt信号通路抑制PTEN基因，进而调节乳腺癌细胞的生长。但关于miRNA-93与白血病的相关研究还很少。

基于以上研究背景及本实验室前期的研究工作，本课题选择可能与ALL的疾病发生、发展相关的miRNA-93为研究对象，检测ALL患者骨髓中的miRNA-93表达水平，同时分析了miRNA-93对急性 T 细胞白血病细胞系Jurkat细胞增殖的影响。

材料和方法

1材料与试剂

急性 T 细胞白血病细胞系Jurkat由郑州大学干细胞中心提供；人淋巴细胞分离液购自GE Healthcare；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、RPMI-1640培养基及Opti-MEM培养基均购于Gibco；LipofectamineTM2000及相关转染试剂购于Invitrogen； 抗cyclin D1、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-depen-dent kinase，CDK)4、p-Rb、Rb、P27及GAPDH抗体购于CST；CCK-8细胞活力分析试剂盒购于广州赖德生物技术有限公司；EdU细胞增殖试剂盒购于广州市锐博生物科技有限公司；细胞周期检测试剂盒购于南京凯基公司；miRNA-93 inhibitor序列及SYBR Green I real-time PCR 试剂盒由上海吉玛制药技术有限公司提供。

2方法

2.1临床标本制备 收集经医院收诊的44例急性淋巴细胞性白血病患儿和5例行骨骼矫正手术并排除肿瘤和血液系统疾病患儿的骨髓样本。采用中国儿童血液病研究组2008方案对选取的ALL患儿进行治疗及临床危险度分型：其中ALL标危患儿17例，中危患儿15例，高危患儿12例。所有实验均经家属知情同意，并报医院伦理委员会批准。骨髓穿刺抽取初诊或者临床化疗前患儿新鲜骨髓2～4 mL，置于EDTA抗凝管中。另取离心管加入3 mL淋巴细胞分离液Ficoll(1.077 g/L)，再加入骨髓液(骨髓液：Ficoll=2∶1或者3∶2)，100×g离心20 min。小心吸取界面层的单核细胞，PBS洗2次。收集细胞冻存于-80 ℃冰箱中备用。

2.2细胞培养、转染和分组 实验用Jurkat细胞接种在预先配制好并过滤除菌的 RPMI-1640 培养基中，于饱和湿度、37 ℃、且5% CO2浓度的培养箱中培养，放入培养箱的瓶口拧开 1 圈，换液间隔为 2～3 d。细胞转染按说明书要求进行，组别设置为对照(control)组，阴性对照(miRNA-negative control，NC)组，miRNA-93 inhibitor转染组。转染步骤如下：转染前 1 d取对数生长期的细胞接种于6孔板中，待细胞生长密度达60%时转入质粒；将miRNA-93 inhibitor和miRNA-negative control分别加入Opti-MEM培养基中室温条件下孵育5 min；同时另取LipofectamineTM2000加入Opti-MEM培养基中室温孵育5 min。将两者混合后室温反应20 min，然后将混合物加入到相应组别的细胞中，置于培养箱中孵育6 h，更换为正常培养基继续培养48 h。对照组则为非转染细胞正常培养相应时间。提取总RNA测定转染效率并进行后续实验分析。

2.3CCK-8法测定细胞活力 将细胞以2×108/L密度接种于96孔板，经过相应处理后，按照操作说明，加入10 μL CCK-8试剂，放置于5% CO2培养箱中孵育2 h，于酶标仪上测450 nm处吸光度(A)值。每组设置3个复孔取均值，另设单孔只加入培养基作空白对照。

2.4EDU法测定细胞DNA变化 将细胞以2×108/L密度接种于96孔板，经过相应处理后，按照操作说明，加入50 μmol/L EDU试剂孵育2.5 h，弃培养液，加入100 μL 4%多聚甲醛固定30 min，再加入0.2%甘氨酸孵育30 min，PBS洗去反应液。0.5% Triton X-100打孔5 min，染色反应液孵育30 min。荧光酶标仪检测激发波长550 nm处红色荧光强度。每组设置3个复孔取均值，另设单孔只加入培养基作空白对照。

2.5流式细胞术检测细胞周期 离心收集各组细胞，冰PBS漂洗2次后离心弃上清；用70%冰乙醇4 ℃固定24 h，1 000×g离心洗去乙醇。依据试剂盒说明，先后加入RNase及碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液在相应的条件下孵育，用流式细胞仪收集20 000个细胞，记录激发波长488 nm处红色荧光强度，分析DNA周期，计算出细胞各期比例。

2.6Western blot测定蛋白水平 加RIPA裂解液提取细胞蛋白， BCA蛋白定量试剂盒定量后，调整各组上样蛋白总量至60 μg，加入4倍体积的蛋白上样缓冲液，95 ℃变性5 min，而后上样进行SDS-PAGE。电泳结束后将蛋白电转至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，按说明书要求加入相应比例的 I 抗4 ℃孵育过夜，复温，TBST洗涤3次，每次5 min；加入对应的 II 抗室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，暗室中显影、定影，冲洗胶片后经Image J软件行蛋白半定量灰度分析。

2.7Real-time PCR实验 依据Trizol说明书提取各组细胞中的总RNA，测定RNA样品的纯度并定量。取2 μg总RNA经 SuperScript III reverse transcriptase逆转录至终体积为20 μL的cDNA，然后依照说明书采用SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒通过ABI 7300 PCR系统检测miRNA-93的表达。PCR反应体系包括：1 μL RT逆转录产物，10 μL SYBR Green PCR Master Mix和500 nmol/L正向以及反向引物。反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，循环50次。U6作为内参照，采用2-ΔΔCt法分析基因相对表达量。引物设计见表1。

表1 引物名称和序列

F: forward； R: reverse.

3统计学处理

所有数据录入SPSS 13.0软件进行统计学分析。实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示。两组计量资料的组间差异采用t检验，多组计量资料行单因素方差分析，同时采用Bonferroni校正的t检验进行均数组间的两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1miRNA-93在急性淋巴细胞白血病患儿体内的表达

Real-time PCR的检测结果显示，其中17例ALL标危患儿体内miRNA-93相对表达水平为1.67±0.09，15例中危患儿体内miRNA-93相对表达水平为2.02±0.15，12例高危患儿体内miRNA-93相对表达水平为2.73±0.14，显著高于5例对照患儿体内miRNA-93的表达水平(0.95±0.06)(P<0.05)。组间两两比较结果显示高危组患儿miRNA-93的表达水平最高，中危组次之，标危组最低。

2沉默miRNA-93对细胞活力的影响

通过转染miRNA-93 inhibitor下调Jurkat细胞中miRNA-93的表达，采用real-time PCR检测转染效率。结果显示转染了miRNA-93 inhibitor后，Jurkat细胞中的miRNA-93表达水平降低至0.47±0.03(P<0.05)。

采用CCK-8法检测细胞活力的变化，结果显示沉默miRNA-93后，Jurkat细胞活力降低至79.42%±5.01%(P<0.05)。采用EDU法检测细胞增殖的变化，结果显示沉默miRNA-93后，Jurkat细胞的增殖率降低至72.15%±8.01%(P<0.05)，见图1。

Figure 1. Detection of transfect efficacy (A) and the effect of miRNA-93 down-regulation on the cell viability (B) and cell proliferation (C) in the Jurkat cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

图1转染效率检测及沉默miRNA-93对细胞活力和增殖的影响

3沉默miRNA-93对细胞周期的影响

进一步采用流式细胞术检测了Jurkat细胞的周期分布情况，沉默miRNA-93后，G0/G1期的细胞所占百分比增加至78.71%±4.93%(P<0.05)，S期细胞所占百分比减少至10.42%±3.17%(P<0.05)，说明沉默miRNA-93可抑制Jurkat细胞周期由G0/G1期向S期转化，见图2。

4沉默miRNA-93对周期相关分子蛋白水平的影响

相较于对照组，沉默miRNA-93后周期相关蛋白cyclin D1、CDK4、p-Rb 的蛋白水平均显著降低，而P27的表达明显升高(P<0.05)。提示沉默miRNA-93所致的细胞增殖抑制作用可能与周期相关因子有关，见图3。

Figure 2. The effect of miRNA-93 down-regulation on the cell cycle distribution in the Jurkat cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

图2沉默miRNA-93对Jurkat细胞周期的影响

Figure 3. The effect of miRNA-93 down-regulation on the protein levels of cell cycle-related molecules in the Jurkat cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

图3沉默miRNA-93对Jurkat细胞周期相关因子蛋白水平的影响

讨 论

miRNA是一种单链小分子RNA，约由19～25个核苷酸组成。目前相当多的研究显示[1-3]，人体中有许多miRNA在肿瘤中起着类似原癌基因或者抑癌基因的作用。且有研究提示，miRNA-93在多种肿瘤中可发挥癌基因样作用。本研究检测到急性淋巴细胞白血病患儿体内miRNA-93的平均表达水平显著升高，与既往的研究具有一致性。通过对患者的临床资料进行进一步的分析，本研究还发现miRNA-93的表达与患者的临床危险度分级具有一定的相关性，危险度越高，miRNA-93的表达水平越高。结果表明，miRNA-93可以作为急性白血病患儿危重分级的一个重要指标来指导临床诊断。

肿瘤的发生发展通常与肿瘤细胞生物学特性的改变密切相关，大量研究显示，肿瘤细胞的恶性增殖是肿瘤形成及发展的关键机制。本实验进一步通过转染miRNA-93 inhibitor，下调急性 T 细胞白血病细胞Jurkat中miRNA-93的表达，分析其对Jurkat细胞增殖的影响。CCK-8细胞活力检测、EDU细胞DNA检测和流式细胞周期检测的结果显示，沉默miRNA-93可降低Jurkat细胞活力，抑制DNA复制，并抑制细胞周期由G0/G1期向S期转化。结果表明沉默miRNA-93可抑制Jurkat细胞增殖。关于miRNA-93影响白血病细胞增殖的机制目前并没有系统的研究。本实验中我们发现下调miRNA-93的表达后，Jurkat细胞中几种周期相关因子cyclin D1、CDK4、、p-Rb 的蛋白水平显著降低，而P27的表达则明显升高。众所周知，miRNA调控肿瘤细胞增殖的相关机制中，细胞周期的变化是一个关键节点[9-11]。调控细胞周期的相关因子包括：细胞周期素(cyclins)、细胞周期蛋白依赖蛋白激酶以及细胞周期蛋白依赖蛋白激酶抑制剂。其中cyclins可与CDKs结合形成复合物，促进Rb的磷酸化，进而促使细胞顺利通过周期G1/S调控点进入S期开始DNA复制；而CDK抑制剂(如P21CIP及P27KIP)则可竞争性与CDK结合，使其催化亚基失活，从而抑制细胞从G0/G1期进入S期[12-14]。我们的结果表明，下调miRNA-93所致的Jurkat细胞周期G1/S阻滞，可能是通过调控周期相关因子的表达实现的，但是这一作用是否涉及其它信号通路以及其中具体的作用机制还需进一步深入地研究。

综上所述，miRNA-93在急性白血病中表达显著升高，且与患者的临床危险度相关；此外，沉默miRNA-93可通过调控周期相关因子的表达抑制细胞周期的G1/S转换，进而抑制急性 T 细胞白血病细胞株Jurkat的增殖。

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(责任编辑： 卢 萍， 余小慧)

Expression of miRNA-93 in acute lymphocytic leukemia

ZHANG Guan-ting, WANG Bao-feng

(Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Hospital of Henan Province Chinese Medicine Institute, Zhengzhou 450004, China. E-mail:2757002991@qq.com)

AIM: To investigate the expression of microRNA (miRNA)-93 in acute lymphocytic leukemia (ALL) and its effect on the proliferation of acute T-cell leukemia Jurkat cells.METHODS: The expression of miRNA-93 in the bone marrow samples of patients with ALL was measured by real-time PCR. After down-regulation of miRNA-93 by transfection with miRNA-93 inhibitor in the Jurkat cells, the cell viability, cell proliferation and cell cycle distribution were detected by CCK-8 assay, EdU assay and flow cytometry, respectively. Furthermore, the protein levels of cell cycle-related molecules such as cyclin D1, cyclin-dependent kinase 4 (CDK4)， phosphorylation retinoblastoma (Rb) and P27 were measured by Western blot.RESULTS: miRNA-93 was highly expressed in the patients with ALL, and the expression level was highest in the high risk patients. Down-regulation of miRNA-93 inhibited Jurkat cell viability, arrested cell cycle in G1/S transition. In addition, the protein levels of cyclin D1, CDK4 and p-Rb were significantly decreased, the protein expression of P27 was increased in Jurkat cells trasfected with miRNA-93 inhibitor.CONCLUSION: miRNA-93 expression is increased in ALL patients. Down-regulation of miRNA-93 restrains cell proliferation in the acute T cell leukemia cell line Jurkat via regulating cell cycle-related molecules.

MicroRNA-93; Acute lymphocytic leukemia; Cell proliferation

(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

1000- 4718(2017)09- 1713- 05

2017- 06- 19 [

] 2017- 07- 21

R733.71； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.029

△通讯作者 Tel： 0371-66347655； E-mail: 2757002991@qq.com