AngⅡ/AT1R通路通过激活人脐静脉内皮细胞PP2A导致eNOS Ser1177磷酸化水平下调*

2017-09-22王阿磊王凌霄姜君财陆德琴

中国病理生理杂志 2017年9期

关键词：磷酸化内皮细胞内皮

王阿磊，丁菁，王凌霄，张倩，黄华，姜君财，陆德琴

(贵州医科大学病理生理教研室，贵州贵阳 550025)

AngⅡ/AT1R通路通过激活人脐静脉内皮细胞PP2A导致eNOS Ser1177磷酸化水平下调*

王阿磊，丁菁，王凌霄，张倩，黄华，姜君财，陆德琴△

(贵州医科大学病理生理教研室，贵州贵阳 550025)

血管紧张素Ⅱ; 血管紧张素Ⅱ1型受体; 蛋白磷酸酶2A; 内皮型一氧化氮合酶; 磷酸化

诸多研究表明，肾素-血管紧张素系统(rennin-angiotensin system，RAS)的激活与高血压、心血管结构重塑、动脉粥样硬化等密切相关[1-2]。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)作为RAS的主要递质，通过作用于其特异性血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin II type 1 receptor，AT1R)可以导致血管内皮功能障碍(vascular endothelial dysfunction，VED)。而VED发生时，内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活性降低，一氧化氮(nitric oxide，NO)合成减少[3]。目前已公认，eNOS/NO功能障碍是VED的重要表现之一。因此，eNOS/NO常被作为反映血管内皮功能的一个重要指标。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)是一种丝/苏氨酸残基蛋白磷酸酶，其通过可逆性的磷酸化使已经磷酸化的蛋白质去磷酸化，从而在多种生物学事件中起着负反馈调节作用[4]。有文献报道PP2A是使磷酸化eNOS (Ser1177)去磷酸化的主要蛋白磷酸酶[5-6]。本课题组在前期双肾单夹肾血管性高血压大鼠的研究中也曾发现，肾血管性高血压大鼠血清AngⅡ水平升高， PP2A活性增强， eNOS Ser1177磷酸化水平下降， eNOS/NO功能障碍。但是关于AngⅡ/AT1R通路激活血管内皮PP2A的分子机制目前尚不清楚。因此，本研究以体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)为实验对象，应用AngⅡ刺激，并给予AT1R特异性阻断剂坎地沙坦(candesartan，CAN)进行干预，初步探讨AngⅡ/AT1R通路激活PP2A的可能分子机制，为临床防治内皮功能障碍相关性心脑血管疾病提供实验依据。

材料和方法

1实验试剂及仪器

2主要方法

2.1HUVECs细胞的培养在超净工作台中将HUVECs接种于培养瓶中，用含有10% FBS的高糖培养基在CO2孵育箱中培养，每隔2 d更换1次培养基以维持细胞良好的生长状态，待细胞生长融合至70%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞传代，待细胞生长到约70%融合时，用含1% FBS的高糖培养基静止培养12 h，使细胞达到同步化后分组用于实验。实验用传15代以内的细胞。

2.2细胞鉴定在6孔板中进行细胞爬片后，待细胞融合至40%～50%时，用含1% FBS的高糖培养基静止12 h，PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定，用兔抗人VIII因子相关抗原抗体和兔抗人CD34抗体作为I抗，按1∶100比例稀释，SABC法进行免疫细胞化学染色。PBS孵育作为阴性对照。镜下胞质内出现棕黄色颗粒即为阳性细胞。200倍显微镜下随机取5个视野计数阳性细胞，计算阳性细胞率(%)=阳性细胞数/细胞总数×100%。

2.3实验分组待HUVECs生长融合至70%～80%左右时，使用含1% FBS的高塘培养基静止培养12 h。将HUVECs随机分为control组、AngⅡ组(AngⅡ终浓度为1×10-7mol/L和1×10-6mol/L，处理12 h)、单纯CAN组和CAN+AngⅡ组。其中单纯CAN组，根据文献报道[7-8]采用对AT1R具有明显阻断作用的CAN，终浓度为1×10-6mol/L。CAN+AngⅡ组中CAN的使用浓度同单纯CAN组，预处理3 h，AngⅡ的使用浓度和时间同AngⅡ组。

2.4Western blot检测蛋白水平提取各组细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度，余蛋白热变性后用SDS-PAGE分离，恒流电转膜至PVDF膜上，5%脱脂牛奶常温封闭1 h，TBST洗膜，加入相应Ⅰ抗4 ℃孵育过夜。第2 d，TBST洗膜，常温孵育相应Ⅱ抗1 h，TBST洗膜，ECL显影曝光。Bio-Rad凝胶成像系统采集图片并分析灰度值，以β-tubulin为内参照，结果以目的条带和β-tubulin条带积分吸光度比值表示，以正常对照组积分吸光度值为100%。以上结果至少重复3批独立实验，每批重复检测3次。

2.5各组培养基中NO含量检测收集培养基后，按照NO检测试剂盒说明书进行操作，检测样品中硝酸盐及亚硝酸盐的含量，通过比色法在全波长酶标仪上测A值。培养基中NO的含量(μmol/L)=(测定A值-空白A值)/(标准品A值-空白A值)×标准品浓度(20 μmol/L)×稀释倍数(4倍)。

3统计分析

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料数据以均数±标准差(Mean±SD)表示。多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐者两两比较采用SNK-q法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1细胞鉴定结果

免疫细胞化学染色结果显示，VIII因子相关抗原和CD34表达阳性的HUVECs细胞质内出现大量棕黄色颗粒，而阴性对照组HUVECs细胞质内未出现棕黄色颗粒。经计算阳性细胞率为100%，见图1。

Figure 1. The expression of factor VIII-related antigen and CD34 in the HUVECs (SABC, ×200). A: negative control; B: the positive expression of factor VIII-related antigen; C: negative control; D: the positive expression of CD34.

图1VIII因子相关抗原和CD34在HUVECs中的表达

2CAN预处理对AngⅡ刺激HUVECs后eNOS蛋白表达和eNOSSer1177磷酸化水平的影响

给予 1×10-7mol/L和1×10-6mol/L的AngⅡ分别处理HUVECs 12 h后，与control组比较，AngⅡ组eNOS Ser1177磷酸化水平下调(P<0.05)；与同一浓度的AngⅡ组比较，CAN预处理组eNOS Ser1177磷酸化水平上调(P<0.05)。各组间eNOS蛋白表达的差异无统计学显著性，见图2。

3各组培养基中NO的含量

给予1×10-7mol/L和1×10-6mol/L的AngⅡ分别处理HUVECs 12 h后，与control组比较，AngⅡ组培养基中的NO含量减少(P<0.05)；与同一浓度的AngⅡ组比较，CAN预处理组培养基中的NO含量增加(P<0.05)，见图3。

4CAN预处理对AngⅡ刺激HUVECs后PP2Ac蛋白表达和PP2AcTyr307磷酸化水平的影响

给予1×10-7mol/L和1×10-6mol/L的AngⅡ分别处理HUVECs 12 h后，与control组比较，AngⅡ组PP2Ac Tyr307磷酸化水平下调(P<0.05)；与同一浓度的AngⅡ组比较，CAN预处理组的PP2Ac Tyr307磷酸化水平上调(P<0.05)。各组间PP2Ac蛋白表达的差异无统计学显著性，见图4。

Figure 2. The protein levels of eNOS and p-eNOS (Ser1177) in the HUVECs treated with AngⅡ and/or CAN for 12 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡ (10-7) group；△P<0.05vsAngⅡ (10-6) group.

图2CAN预处理对AngⅡ刺激HUVECs后eNOS蛋白表达和eNOSSer1177磷酸化水平的影响

Figure 3. NO content in the culture medium in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng II (10-7)group;△P<0.05vsAng II (10-6) group.

图3各组培养基中NO含量的变化

Figure 4. The protein levels of PP2Ac and p-PP2Ac (Tyr307) in the HUVECs treated with AngⅡ and/or CAN for 12 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡ (10-7) group;△P<0.05vsAngⅡ (10-6) group.

图4CAN预处理对AngⅡ刺激HUVECs后PP2Ac蛋白表达和PP2AcTyr307磷酸化水平的影响

讨论

本研究中所使用的HUVECs经SABC法鉴定为高纯度的内皮细胞，该细胞株已经被广泛用于内皮细胞的相关研究，因此可用于本研究观察内皮细胞经AngⅡ刺激后eNOS磷酸化和PP2A活性的改变及可能的机制。

1AngⅡ下调eNOSSer1177磷酸化水平由AT1R介导

eNOS的活性调控是一个复杂过程，包括基因转录、翻译和翻译后水平的调控。目前已知eNOS Ser1177是eNOS在翻译后多个磷酸化调控位点中非常重要的位点之一，该位点磷酸化可显著上调eNOS活性。大量研究已表明，心血管疾病发病过程中内皮依赖的血管舒张功能受损的表现之一为eNOS Ser1177磷酸化水平下调，eNOS活性降低，NO合成减少[9-11]。特异性AT1R阻断剂如CAN、洛沙坦等，能减轻高血压、动脉粥样硬化等疾病所引起的内皮功能障碍。有研究报道AngⅡ可通过作用于AT1R，引起内皮细胞中eNOS Ser1177磷酸化水平下调，NO合成减少，而eNOS蛋白表达无明显变化[12]。而CAN可上调eNOS蛋白表达，增加eNOS活性，从而发挥内皮细胞保护作用[13]。但也有研究报道CAN可上调eNOS Ser1177磷酸化水平，增强eNOS活性，促进NO释放，但对eNOS蛋白表达无明显影响[8]。本研究对HUVECs中eNOS蛋白表达、eNOS Ser1177磷酸化水平和培养基中NO含量进行了检测。结果显示，AngⅡ处理组eNOS蛋白表达无明显变化，eNOS Ser1177磷酸化水平明显下调，NO产量减少，CAN预处理虽未改变eNOS蛋白的表达水平，但可明显上调eNOS Ser1177磷酸化水平。这提示在HUVECs中AngⅡ可通过AT1R介导的信号通路下调eNOS Ser1177磷酸化水平，降低eNOS活性，减少NO的合成，AngⅡ和CAN均对eNOS蛋白表达水平无明显影响。

2AngⅡ/AT1R通路激活HUVECs中PP2A可能的分子机制

Michell等[5]已报道PP2A能使eNOS的Ser1177位点发生去磷酸化。本课题组在前期双肾单夹肾血管性高血压大鼠的研究中发现，肾血管性高血压大鼠血清AngⅡ水平升高，PP2A活性增强，eNOS Ser1177磷酸化水平下降，eNOS/NO功能障碍。那么，在AngⅡ/AT1R通路导致eNOS Ser1177磷酸化水平降低的过程中，PP2A活性增强的分子机制如何，目前尚未完全阐明。

文献报道，神经酰胺可激活PP2A，后者调控eNOS活性，即可以通过去磷酸化蛋白激酶B (Akt)，进一步下调eNOS Ser1177磷酸化水平，也可以直接使磷酸化eNOS (Ser1177)去磷酸化，从而使eNOS活性降低[6]。在全反式维甲酸诱导的内皮功能障碍的研究中发现，给予PP2Ac亚基 siRNA可降低PP2A活性，导致eNOS Ser1179磷酸化水平上调[18]，表明PP2A可直接使eNOS Ser1177位点去磷酸化。本实验所观察的AngⅡ通过AT1R通路下调eNOS Ser1177磷酸化水平，是PP2A活性增强后的直接去磷酸化作用，还是通过其它蛋白激酶如Akt的间接作用，还有待进一步研究。

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(责任编辑：卢萍，罗森)

AngⅡ/AT1R pathway activates PP2A to down-regulate p-eNOS (Ser1177) in human umbilical vein endothelial cells

WANG A-lei, DING Jing, WANG Ling-xiao, ZHANG Qian, HUANG Hua, JIANG Jun-cai, LU De-qin

(Department of Pathophysiology, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China. E-mail: dqlu91@hotmail.com)