三氧化二砷对MRL/lpr狼疮鼠T-bet/GATA3信号通路的影响*

朱晓芳， 胡宏叶， 李永吉， 朱小春， 张 章， 陈 丹△

(温州医科大学附属第一医院 1风湿免疫科， 2肿瘤外科， 浙江 温州 325000)

三氧化二砷对MRL/lpr狼疮鼠T-bet/GATA3信号通路的影响*

朱晓芳1， 胡宏叶2， 李永吉1， 朱小春1， 张 章1， 陈 丹1△

(温州医科大学附属第一医院1风湿免疫科，2肿瘤外科， 浙江 温州 325000)

目的： 本文旨在探讨三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)对MRL/lpr狼疮鼠T-bet/GATA3信号通路的影响及其作用机制。方法: 将20周龄MRL/lpr狼疮鼠和正常C57BL/6J小鼠随机分组，分别接受ATO (0.4 mg·kg-1·d-1)和同体积生理盐水(NS)治疗2个月，分离脾脏淋巴细胞，然后用实时荧光定量PCR法检测T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-4的mRNA水平及T-bet/GATA3 mRNA的比值，Western blot法检测T-bet和GATA3的蛋白表达，ELISA法检测血清中IFN-γ和IL-4的浓度。结果: (1)MRL/lpr狼疮鼠NS组T-bet、IFN-γ的mRNA及蛋白表达、T-bet/GATA3 mRNA比值均高于C57BL/6J小鼠NS组(P<0.05)，而GATA3、IL-4的mRNA及其蛋白表达均低于C57BL/6J小鼠NS组(P<0.05)；(2) 在MRL/lpr狼疮鼠中，与NS组相比，ATO组T-bet、IFN-γ的mRNA及蛋白表达、T-bet/GATA3 mRNA比值均下降(P<0.05)，而2组中GATA3、IL-4的mRNA及蛋白表达无明显差异；(3) 在C57BL/6J小鼠中，NS组和ATO组之间以上指标均无显著性差异。结论: ATO可能通过影响MRL/lpr狼疮鼠T-bet/GATA3信号通路，降低T-bet表达，从而减少Th1型细胞因子IFN-γ的表达和分泌。

三氧化二砷； MRL/lpr狼疮鼠； T-bet/GATA3信号通路； IFN-γ； IL-4

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种病因不明的，以自身抗体产生过多和多器官受累为特点的自身免疫性疾病[1]。研究发现Th1/Th2比例的失衡及其相应细胞因子网络的紊乱是导致SLE发病的重要机制[2-3]。而Th细胞分化是由相关的转录因子调控，其中T-bet(T-box基因家族新型的转录因子)和GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3，GATA3)分别是Th1和Th2细胞分化的主要驱动者[4]，二者表达异常可以影响免疫应答,从而导致免疫调控网络失衡。并且有研究表明SLE病人及狼疮模型鼠中存在T-bet/GATA3信号通路的异常[5]。三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是我国传统中药砒霜的主要成分，已成功应用于急性白血病及一些肿瘤的治疗[6-7]。国外研究[8]及我们的前期研究[9-10]均表明ATO是一种治疗SLE很有前景的药物，但ATO是否是通过对MRL/lpr狼疮鼠T-bet/GATA3信号通路的影响来调节狼疮鼠Th1/Th2比例的失衡是本次研究的目的。

材料和方法

1动物

20周龄MRL/lpr狼疮鼠20只，体重36～42 g，20周龄C57BL/6J小鼠20只，体重20～22 g，购自中国科学院上海实验动物中心，饲养在温州医学院动物实验中心SPF级动物房。

2主要试剂和器材

三氧化二砷钠注射针剂(哈尔滨伊达药业有限公司)；小鼠淋巴细胞分离液(北京索莱宝)；鼠细胞因子ELISA试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)；Trizol购自Invitrogen；RT-qPCR试剂盒购自TOYOBO；实验中所用引物由Invitrogen合成，具体序列见表1；实时荧光定量PCR 仪采用ABI的StepOne Plus Real-time PCR System；垂直电泳仪(Bio-Rad)；酶标仪(Bio-Tek)。

3主要方法

3.1实验分组 MRL/lpr狼疮鼠和C57BL/6J小鼠均随机平均分成2组：(1)ATO组：0.4 mg·kg-1·d-1，腹腔注射；(2)生理盐水(NS)组：作为阴性对照组，根据ATO溶液体积按体重取量，腹腔注射。给药持续2个月，于实验起点和终点采尾血标本，分离血清于 -70 ℃保存待测。

表1 引物序列

3.2脾脏淋巴细胞制备 药物或NS作用2月后，颈椎脱臼法处死小鼠后，无菌条件下取出脾脏，用200目筛网轻轻研磨脾脏过滤成单细胞悬液，采用密度梯度离心法自脾脏单细胞悬液中分离小鼠淋巴细胞，用冷PBS洗涤2次，重悬于10% FCS-RPMI-1640中，调整细胞浓度为2×109/L，台盼蓝染色法测定细胞存活率(>98%)。

3.3血清IFN-γ、IL-4浓度的测定 采用ELISA法，严格按试剂盒说明书操作，显色后在全自动酶标仪上450 nm波长处读取吸光度(A)值，通过绘制标准曲线求出指标含量。

3.4实时荧光定量PCR法检测各组细胞T-bet、GATA3、IFN-γ及IL-4 mRNA的表达 用Trizol法抽提RNA，测定RNA浓度，取 2 μg的RNA按照说明书进行逆转录反应。以β-actin 为内参照，用实时荧光定量PCR进行T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-4以及β-actin 产物扩增及结果分析。PCR循环条件设置为:94 ℃10 min；94 ℃ 20 s、60 ℃ 1 min，扩增50个循环；反应完成后再于95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s绘制熔解曲线。根据Livak和Schmittgen设计的阈值法测定目的基因的相对表达水平，目的基因量以2-ΔΔCt法计算，将C57BL/6J小鼠NS组(C57 NS)作为样本校正，其表达水平设置为1，ΔΔCt=[Ct目的基因(其它实验组)-Ct内参照(其它实验组)]-[Ct目的基因(C57 NS)-Ct内参照(C57 NS)]。

3.5Western blot法检测T-bet、GATA3蛋白的表达 收集脾脏淋巴细胞，用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法检测待测蛋白的浓度。将10 μg蛋白样品与4倍体积上样缓冲液混匀，100 ℃加热10 min充分变性。经15% SDS-PAGE后，转移至PVDF膜。加入5%脱脂奶粉室温2 h封闭。加 I 抗GATA3、T-bet(1∶500稀释)4℃孵育过夜。加 II 抗IgG(1∶5 000稀释)室温孵育2 h。应用ECL发光液，曝光成像。图像经Quantity One分析软件分析各条带的光密度值，以GAPDH作为内参照，比较各组T-bet、GATA3分别与GAPDH的灰度比值。

4统计学处理

使用SPSS 17.0统计学软件进行分析。实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，进行方差齐性检验后根据样本的性质采用两样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1RT-qPCR法分析各组T-bet、GATA3、IFN-γ及IL-4的mRNA表达

与C57BL/6J小鼠NS组相比，MRL/lpr狼疮鼠NS组T-bet和IFN-γ的mRNA表达升高，而GATA3和IL-4的mRNA表达下降。ATO能下调MRL/lpr狼疮鼠T-bet和IFN-γ的mRNA表达，而ATO对MRL/lpr狼疮鼠GATA3和IL-4的mRNA表达无明显影响。ATO对C57BL/6J小鼠的T-bet、GATA3、IFN-γ和IL-4 mRNA 的表达无明显影响，见图1。

Figure 1. Samples were analyzed by RT-qPCR to measure the mRNA levels of T-bet, GATA3, IFN-γ and IL-4. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC57BL/6J NS group;#P<0.05vsMRL/lpr NS group.

图1实时荧光定量PCR分析各组T-bet、GATA3、IFN-γ及IL-4的mRNA表达

2分析各组T-bet/GATA3mRNA比值的变化

与C57BL/6J小鼠NS组相比，MRL/lpr狼疮鼠NS组T-bet/GATA3 mRNA比值升高，ATO能下调MRL/lpr狼疮鼠T-bet/GATA3 mRNA比值，见表2。

3Westernblot法分析各组T-bet和GATA3蛋白的表达

与C57BL/6J小鼠NS组相比，MRL/lpr狼疮鼠NS组中T-bet蛋白表达升高，而GATA3蛋白表达下降。ATO能下调MRL/lpr狼疮鼠中T-bet的蛋白表达，而对GATA3的蛋白表达无明显影响。ATO对C57BL/6J小鼠的T-bet和GATA3蛋白表达无明显影响，见图2。

表2 各组T-bet/GATA3 mRNA比值的比较

**P<0.01vsC57BL/6J NS group;#P<0.05vsMRL/lpr NS group.

Figure 2. The protein expression of T-bet and GATA3 in MRL/lpr mice and C57BL/6J mice were determined by Western blot analysis. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC57BL/6J NS group;#P<0.05vsMRL/lpr NS group.

图2Westernblot法检测各组T-bet和GATA3的蛋白表达

4ELISA测定血清中IFN-γ和IL-4浓度的变化

用ELISA法检测各组外周血IFN-γ和IL-4的浓度，结果发现，与C57BL/6J小鼠NS组相比，MRL/lpr狼疮鼠NS组中血清IFN-γ的分泌升高，IL-4的分泌下降。ATO能减少MRL/lpr狼疮鼠中IFN-γ的分泌，而对IL-4的分泌无明显影响。ATO对C57BL/6J小鼠IFN-γ和IL-4的分泌无明显影响，见图3。

Figure 3. The serum levels of IFN-γ and IL-4 in the MRL/lpr mice and C57BL/6J mice. Mean±SD.n=10.*P<0.05，**P<0.01vsC57BL/6J NS group;##P<0.01vsMRL/lpr NS group.

图3ELISA法检测各组小鼠血清中IFN-γ和IL-4的浓度

讨 论

SLE是一种原因不明的累及多系统的自身免疫性疾病[1]，在SLE的治疗中糖皮质激素和免疫抑制剂仍然是一线治疗药物，这些药物能延长患者的寿命，但是往往伴随严重的毒副作用[11]，这为寻找新的治疗SLE的高效低毒的药物提供契机。Bobé等[8]的研究表明砷制剂ATO在SLE的治疗中有较好的疗效，而我们的前期研究[9-10]也证实ATO能延长狼疮鼠的寿命，改善狼疮鼠的病情，并伴有较少的毒副作用，但ATO治疗SLE的具体机制尚待进一步的研究。有研究发现SLE中存在转录因子T-bet/GATA3信号通路的表达异常[5]，但ATO是否通过T-bet/GATA3信号通路对SLE起到治疗作用尚不清楚，因此本研究以MRL/lpr狼疮鼠为试验对象，观察ATO对MRL/lpr狼疮鼠T-bet/GATA3信号通路的影响。

T淋巴细胞在SLE的发病中有着重要的作用，然而初始T细胞转化为Th1、Th2的过程中受多种因素影响，其中转录因子T-bet和GATA3在Th细胞分化发育中发挥重要的作用。T-bet是近年哈佛大学的Szabo等[12]发现的重要的Th1转录因子，它在Th1细胞的分化及效应功能维持中起了关键的作用，研究发现T-bet正调控Th1细胞的发育，引起Th1型细胞因子IFN-γ基因的染色质重塑，激活IFN-γ基因转录[12]。而GATA3属于GATA转录因子家族，在Th2细胞分化中发挥了中心性的作用，GATA3正调控Th2细胞的发育，引起Th2型细胞因子IL-4基因染色质重塑，从而诱导IL-4的产生[13]。近来一些研究表明，通过一些干预调节T-bet、GATA3的活性，可以引起Th1/Th2的变化，从而达到控制疾病的目的[14]。

文献报道SLE的免疫紊乱趋向于以Th1型为主，表现为以IFN-γ为代表的Th1型细胞因子显著升高，从而引发相关的组织脏器损伤[15]。在本次实验中，我们发现与正常C57BL/6J小鼠相比，MRL/lpr狼疮鼠中T-bet/GATA3 mRNA比值升高，转录因子T-bet的mRNA及其蛋白表达升高，而GATA3的mRNA及其蛋白表达下降。同时，我们发现MRL/lpr狼疮鼠中Th1型细胞因子IFN-γ的表达与分泌增加，Th2型细胞因子IL-4的表达与分泌下降。这一结果表明SLE是以Th1型细胞因子水平升高，Th2型细胞因子水平下降为特点的Th1/Th2偏移性免疫性疾病。本次研究中我们还发现，MRL/lpr狼疮鼠经ATO干预后，T-bet/GATA3 mRNA比值下降，转录因子T-bet的mRNA及其蛋白表达下降，IFN-γ的表达与分泌下降。并且IFN-γ的表达增减与T-bet/GATA3 mRNA比值、转录因子T-bet的表达增减相一致，故而我们可以估测ATO可能通过调节SLE异常的T-bet/GATA3信号通路，下调T-bet/GATA3 mRNA比值，抑制T-bet的表达，干预T细胞分化的上游环节，进而抑制Th1型免疫反应，而趋向于保护性的Th2型反应。而Bobé 等[8]研究证实ATO能减少IL-18、IFN-γ的分泌，减轻组织损伤，这也从另一侧面反映了ATO可以阻断Th1型免疫反应，从而达到治疗SLE的目的。

综上所述，我们可以推测ATO可能通过影响T-bet/GATA3信号通路，下调T-bet的表达，抑制Th1型免疫反应，减少Th1型细胞因子IFN-γ的表达和分泌，从而使狼疮鼠失衡的Th1/Th2反应相对地向Th2型免疫反应方向漂移。但ATO又是通过什么途径或什么机制使T-bet转录因子发生变化，还待进一步研究。

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Effects of arsenic trioxide on T-bet/GATA3 signal pathway in MRL/lpr mice

ZHU Xiao-fang1, HU Hong-ye2, LI Yong-ji1, ZHU Xiao-chun1, ZHANG Zhang1, CHEN Dan1

(1Department of Rheumatology，2Department of Surgical Oncology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China. E-mail: june8587@outlook.com)

AIM: To investigate the effect of arsenic trioxide (ATO) on T-bet/GATA3 signal pathway in MRL/lpr mice.METHODS: MRL/lpr mice and C57BL/6J mice at the age of 20 weeks were chosen and then divided in 2 different sub-groups， respectively. The mice in 2 sub-groups

ATO (0.4 mg·kg-1·d-1) and sodium chloride (NS, volume weight-determined) by intraperitoneal injection respectively for 2 months. Afterward, the spleens were isolated from the MRL/lpr and C57BL/6J mice under pathogen-free condition and the suspensions were prepared. The mRNA level of T-bet, GATA3, IFN-γ,IL-4 and the mRNA ratio of T-bet/GATA3 were detected by RT-qPCR. The protein expression of T-bet and GATA3 was determined by Western blot. The serum levels of IFN-γ and IL-4 were measured by ELISA.RESULTS: The mRNA and protein levels of T-bet， IFN-γ and the mRNA ratio of T-bet/GATA3 in NS group of MRL/lpr mice were higher than those in NS group of C57BL/6J mice (P<0.05). However, the GATA3 and IL-4 were lower in NS group of MRL/lpr mice in both mRNA and protein level (P<0.05 ). In MRL/lpr mice, the mRNA and protein levels of T-bet, IFN-γ and the mRNA ratio of T-bet/GATA3 were lower in ATO group compared with NS group (P<0.05), no difference was found in GATA3 and IL-4. No difference of the indexes mentioned above between ATO group and NS group in C57BL/6J mice was observed.CONCLUSION: ATO may affect the signaling pathway of T-bet/GATA3 to down-regulate the mRNA expression and the protein secretion of IFN-γ by decreasing the expression of T-bet in MRL/lpr mice.

Arsenic trioxide; MRL/lpr mice; T-bet/GATA3 signal pathway; IFN-γ; IL-4

1000- 4718(2017)09- 1708- 05

2017- 03- 03 [

] 2017- 07- 18

温州科技局重大项目(No. Y20090240)

R593.2； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.028

△通讯作者 Tel： 0577-55579268； E-mail： june8587@outlook.com