循环 miR-106a/b 表达水平在肝细胞癌的诊断及预后中的作用

唐津天，王伯庆，唐泽天，佟庆，薛峰，徐林，易超，晏冬

（1. 新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科，乌鲁木齐 830011；2. 新疆维吾尔自治区人民医院泌尿外科，乌鲁木齐 830002）

循环 miR-106a/b 表达水平在肝细胞癌的诊断及预后中的作用

唐津天1，王伯庆1，唐泽天2，佟庆1，薛峰1，徐林1，易超1，晏冬1

（1. 新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科，乌鲁木齐 830011；2. 新疆维吾尔自治区人民医院泌尿外科，乌鲁木齐 830002）

目的评估循环 miR-106a/b 表达水平在肝细胞癌（HCC）诊断及预后中的作用。方法纳入 108 例 HCC 患者和 54 例健康志愿者（HCs），采集受试者外周血，并采用实时荧光定量 PCR 进行 miR-106a/b 表达水平的检测。对 HCC 患者进行随访，并记录其总体生存期（OS）。结果HCC 患者中血浆 miR-106a 表达水平显著高于 HCs（P ＜ 0.001）。血浆 miR-106b 在 HCC 患者中表达同样升高（P ＜ 0.001）。受试者工作特征曲线显示 miR-106a/b 的诊断效能较好，曲线下面积分别为 0.670（95%CI：0.573～0.768）和 0.684（95%CI：0.593～0.776）。HCC 患者中循环 miR-106a 表达量与乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）（P=0.028）、病理分化（P=0.025）、肿瘤大小（P=0.002）、淋巴结转移（P=0.028）以及 TNM 分级（P=0.037）正相关；miR-106b 表达量与 HBsAg（P=0.003）、AFP（P=0.031）以及肿瘤大小（P=0.005）正相关。Kaplan-Meier曲线分析显示，血浆 miR-106a高水平的 HCC 患者具有较差的 OS（P=0.013）。多因素 Cox 回归模型分析显示，miR-106a 高表达是 HCC 患者 OS 差的独立预测因素（P=0.038）。结论循环 miR-106a/b 表达水平可作为 HCC 患者的诊断标志物，且循环miR-106a高表达是 HCC 患者预后不良的独立预测因素。

循环；miR-106a/b；肝细胞癌；诊断；预后

肝细 胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势［1］，其起病隐匿，确诊时通常已是中期或晚期，因此 HCC 患者的预后差，生存率低［2-3］。多数 HCC 由慢性肝病发展而来，包括肝硬化及病毒性肝炎，其中 乙 型 肝 炎 病 毒（hepatitis B virus，HBV）感 染 是HCC 发病最主要的风险因素［1，4］。microRNAs（miRNA）是一类小分子非编码RNA，近年来已被证实可以通过调控细胞的增殖分化、凋亡以及转移，在HCC的发病中发挥重要作用［5-7］。microRNA-106（miR-106）属于 miR-17 家族，包括 miR-106a 和 miR-106b，已有一系列研究［8-9］显示 miR-106 在一些肿瘤中存在不同程度的表达失调。然而，miR-106a/b 在 HCC 诊断及预后中的作用尚不明确。因此，本研究旨在探究循环 miR-106a/b 表达水平在 HCC 诊断及预后中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2010年10月至2012年9月于新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科经组织病理学确诊为HCC，并且确诊后未接受化疗、放疗及手术治疗的患者 108 例。病例排除标准为：（1）有其他恶性肿瘤病史者；（2）合并认知损害的患者；（3）合并严重感染的患者；（4）依从性差或无法理解研究流程者。同时纳入54例体检中心年龄与性别匹配的健康志愿者作为健康对照组。本研究经新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 样本采集与处理

采集HCC患者及健康志愿者外周血样本，并保存于 乙 二胺 四 乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）管中。达到室温 2 h 后，将样本置于 4 ℃3 000 r/min 离 心 10 min，取 得 血 浆 后 立 即 于 4 ℃12 000 r/min 离心 10 min，并将血浆置于-80 ℃冰箱中待用。

1.3 实时荧光定量PCR

采用 TRIzol LS Reagent（美 国 Invitrogen 公司）试剂盒抽提血浆总RNA，并采用分光光度计测定总RNA 的浓度和纯度。严格按照操作说明使用 PrimerScript Real-time 试剂盒（日本 TaKaRa 公司）进行RNA 逆转录，miRNA 表达水平定量测定采用 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（日本 TaKaRa 公司）试剂盒。采用U6作为内参对照，每个孔设3个复孔，取3个复孔的平均 Ct值为最终 Ct值，并采用 2-△△Ct法计算目标基因的相对含量。

1.4 统计学分析

采用 SPSS 21.0 软件进行统计学分析。数据表示为计数、中位值（25～75分位值）。组间差异比较采用 Wilcoxon 秩和检验。行受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲 线进 行 miR-106a/b 对 HCC 发病的风险分析，采用 Kaplan-Meier方法和 log-rank 分析 miR-106a/b 与 HCC 患者总体生存率（overall survival，OS）的关系，采用单因素、多因素Cox风险比回归分析模型评估患者基线期特征对OS的影响，单因素分析中P＜ 0.1的因素进一步纳入多因素回归模型分析。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 受试者基本信息

108例HCC患者中，≥60岁者52例（48%），＜60岁者 56 例（52%）；男83例（77%），女 25 例（23%）。临床病理特征：低分化52例（48%），中/高分化56例（52%）；TNM 分级：Ⅰ/Ⅱ级 56 例（54%），Ⅲ/Ⅳ级 50例（46%）。见表1。

2.2 血浆 miR-106a/b 表达量与 HCC 患者临床、病理特征的关系

HCC 患者中 miR-106a 表达量与乙型肝炎病毒表 面 抗 原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）（P= 0.028）、病理分化（P=0.025）、肿瘤大小（P=0.002）、淋巴结转移（P=0.028）以及 TNM 分级（P=0.037）呈正相关，与年龄、性别、甲胎蛋白（alpha fetal protein，AFP）等 无 关 ；miR-106b 表 达 量 与 HBsAg（P= 0.003）、AFP（P=0.031）以及肿瘤大小（P=0.005）呈正相关，与年龄、性别、病理分化以及淋巴结转移等无关，见表1。

2.3 血浆 miR-106a/b 在 HCC 患者中高表达

相对于健康志愿者，血浆 miR-106a在 HCC患者中 的 表 达 显 著 升 高［4.936（3.371～5.651）vs 3.001（2.168～5.251），P ＜ 0.001］；同时，血浆 miR-106b 在HCC 患者中表达同样升高（5.159（4.423～6.771）vs 3.995（3.271～5.637），P＜ 0.001］。

进一步采用 ROC 曲线分析表明，miR-106a可区分 HCC 与 健 康 人 群 ，曲 线 下 面 积（area under the curve，AUC）为 0.670（95%CI：0.573～0.768）；miR-106b同样可以区分 HCC 与健康人群，AUC 为 0.684（95% CI：0.593～0.776），见图 1。

2.4 血浆 miR-106a/b 表达水平与 HCC 患者 OS 的关系

按照 miR-106a在所有 HCC 患者中表达量的中位值 4.396，将 HCC 患者分为 2 组：miR-106a≥ 4.396为高表达组，miR-106a＜4.396 为低表达组；按照 miR-106b 在所有 HCC 患者中表达量的中位值 5.159，将HCC 患者分为 2 组：miR-106b≥ 5.159 为高表达组，miR-106b＜5.159 为低表达组。采用 Kaplan-Meier曲线和 log-rank 检验，发现 miR-106a 高表达组的 OS 显著低于低表达组（P=0.013）；然而 miR-106b 高表达组和低表达组的 OS 无统计学差异（P=0.107），见图2。

表1 血浆 miR-106 a/b 表达量与 HCC 患者临床病理特征的关联Tab.1 Correlations of plasma miR-106 a/b expression with clinicopathological features in patients with HCC

2.5 血浆 miR-106a高表达是预测 HCC 患者预后差的独立风险因素

采用单因素Cox回归模型分析基线期HCC患者的 miR-106a/b 表达量及临床、病理特征对于患者 OS的影响，发现 miR-106a 高表达与患者 OS 差显著相关（HR=1.635，95%CI：1.096～2.441，P=0.016），此外，肿瘤大小（HR=1.685，95%CI：1.130～2.513，P= 0.011）、淋 巴 结 转 移（HR=1.849，95%CI：1.060～3.227，P=0.030）以 及 TNM 分 级（HR=1.536，95% CI：1.032～2.288，P=0.035）也是 OS 差的预测因素；miR-106b的表达水平与患者 OS不相关，见表 2。

图1 血浆 miR-106a/b 对 HCC 诊断价值的 ROC 曲线Fig.1 ROC curve of Plasma miR-106a/b for diagnosing HCC

进一步采用多因素Cox回归模型分析HCC患者OS 的预测因素，结果显示 miR-106a高表达是患者OS 差 的 独立预测因素（HR=1.528，95%CI：1.024～ 2.280，P=0.038）。 除 此 之 外 ，淋 巴 结 转 移（HR= 1.984，95%CI：1.074～3.665，P=0.029）和 TNM 分级（HR=1.649，95%CI：1.108～2.456，P=0.014）也是 OS差的独立预测因素。

3 讨论

本研究通过检测 HCC 患者血浆中 miR-106a/b的表达水平，分析其与临床、病理特征的关联，并探讨 miR-106a/b 在 HCC 诊断及预后中的作用。结果表明：（1）相对于健康志愿者，HCC患者血浆miR-106a/b的表达水平均显著升高。进一步ROC曲线分析显示，miR-106a/b 具有较好的 HCC 诊断效能。（2）HCC患者血浆 miR-106a的表达量与 HBsAg、病理分化、肿瘤大小、淋巴结转移以及TNM分级正相关，而miR-106b 的表达量仅与 HBsAg、AFP 以及肿瘤大小正相关。（3）血浆 miR-106a 高表达与较差的 OS 相关，并且miR-106a是 HCC 患者预后差的独立风险因素。

图2 miR-106a/b 表达量与 OS 的关系（K-M 曲线）Fig.2 Correlation of miR-106a/b Expression with OS（K-M curve）

HCC是目前世界上引发癌症相关死亡的主要癌症之一，并且是绝大部分肝硬化患者的最终死亡原因［1，10］。尽管 目 前的诊断和治疗手段 已 有所改进，HCC的早期诊断以及预后改善仍存在较大的困难［3］。miRNA 是一类长度为 13～25 个核苷酸的小分子非编码RNA，它能通过与靶基因3’端非翻译序列结合来促进靶基因降解或抑制翻译过程，从而抑制靶基因表达［11］。已有越来越多的研究［12-13］证明，miRNA 可以通过调控多种生物活性物质参与HCC的发病机制，如自噬相关基因 7（autophagy-related gene 7，ATG7）、丝裂原激活的蛋白激酶/MAP 激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）以 及 细 胞周期调控因子。

miR-106a属于 miR-106a-163 基因簇，近年来已有 研 究［14］显示其在不同的肿 瘤 中发挥致癌作用。ZHU 等［15］研究发现，miR-106a 可以通过促进细胞的增殖和转移，在胃癌中发挥“促癌基因”的功能。另有 1 项研究［16］显示，miR-106a 能够调控磷酸酶及张力蛋白同源物，并且通过这个机制来促进卵巢癌细胞的分化和转移。本研究中，miR-106a的表达水平在 HCC 患者的血浆中显著上调，并且与 HBsAg、病理分化、肿瘤大小、淋巴结转移以及TNM分级正相关，这与其他几项关于胃癌、胰腺癌以及胆管癌的基 础 研 究［17-19］结 果 一 致 。 与 此 同时 ，已 有多 项研究［20］结果显示，miR-106a 与癌症的预后有关。1 项采用直接定量法的实验结果表明，转移性乳腺癌患者外周血 miR-106a水平升高，提示其是转移性乳腺癌患者的预后因素。另外，有研究［21］认为，miR-106a或可以作为结直肠癌未转移的生物标志物，并且外周血高表达的 miR-106a 与结直肠癌的不良预后密切相关。本研究中，血浆 miR-106a高表达的 HCC 患者具有较差的OS，单因素以及多因素Cox回归分析显示，miR-106a高表达是 HCC 患者预后差的独立风险因素，这可能由于 miR-106a 高表达促进肿瘤分化、增殖、迁徙；miR-106a高表达可以抑制化疗敏感度［22］。

表2 影响OS的基线期因素分析（单因素、多因素Cox回归分析）Tab.2 Analysis of factors at baseline influencing OS（univariate and multivariate Cox regression analysis）

miR-106b 位于染色体 7q 22.1，属于 miR-106b-25 基因簇［23］。miR-106b 的促癌作用同样在近几年的研究中得到了证实，1 项关于结肠癌的研究［24］结果显示，miR-106b 通过靶向调控肌动蛋白轻链 1（dynein light chain 1，DLC1）促进细胞的转移和侵袭力。miR-106b 在 HBV 感染性 HCC 当中同样起着促进癌症进展的作用［25］。本研究结果显示，HCC 患者血浆 miR-106b 的表达水平与 HBsAg、AFP 以及肿瘤大小正相关，然而与其他的临床、病理特征不相关，与患者OS也无关联。

本研究存在一些不足：HCC患者的治疗信息未进行详细记录和分析，这可能会影响患者预后分析的结果。然而，大部分HCC患者治疗手段均为手术或化、放疗，可能其偏倚不会太大。研究共纳入HCC患者108例，样本量相对较少，因此可能导致部分指标统计缺乏效能而无法发现其统计学意义。miR-106a通过哪个靶基因影响 HCC 患者预后机制未进行研究。因此，本研究今后的研究方向为在扩大样本量的基础上评估 miR-106a以及靶基因的表达水平与HCC临床病理特征以及预后的关系。

综上所述，本研究表明，循环 miR-106a/b 表达水平可作为 HCC 患者的诊断标志物，并且循环miR-106a高表达是 HCC 患者预后不良的独立预测因素。

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（编辑 于 溪）

The Role of miR-106a/b Expression Levels in the Diagnosis and Prognosis of Hepatocellular Carcinoma

TANG Jintian1，WANG Boqing1，TANG Zetian2，TONG Qing1，XUE Feng1，XU Lin1，YI Chao1，YAN Dong1

（1.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery，Xinjiang Medical University Affiliated Tumor Hospital，Urumchi 830011，China；2.Department of Urology，The Xinjiang Uygur Autonomous Region People’s Hospital，Urumchi 830002，China）

ObjectiveTo investigate the role of microRNA-106a and microRNA-106b（miR-106a/b）in diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma（HCC）.MethodsIn this study，108 HCC patients and 54 age-and sex-matched healthy controls were enrolled.Blood samples were collected from each participant，and total RNA was extracted from the plasma.We determined miR-106a/b expression levels using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（qRT-PCR）.ResultsThe miR-106a/b expression levels in HCC patients were elevated compared with the healthy controls（P ＜ 0.001）.The ROC curve analysis showed that miR-106a/b expression levels could be used to predict the risk of HCC，with AUC values of 0.670（95%CI：0.573-0.768）and 0.684（95%CI：0.593-0.776），respectively.The miR-106a expression level in HCC patients correlated positively with hepatitis B surface antigen（HBsAg）presence（P=0.028），differentiation（P=0.025），tumor size（P= 0.002），lymph node metastasis（P=0.028），and TNM stage（P=0.037）.The miR-106b expression level correlated positively with HBsAg presence（P=0.003），alpha-fetoprotein（AFP）level（P=0.031），and tumor size（P=0.005）.To further investigate the correlation of miR-106a/b expression levels with overall survival（OS），Kaplan-Meier curves were plotted.The results showed that HCC patients with high miR-106a expression displayed shorter OS（P=0.013）.In addition，univariate and multivariate Cox proportional hazards regression showed that miR-106a was an independent risk factor for HCC prognosis.ConclusionCirculating miR-106a/b expression levels could be used as diagnostic biomarkers for HCC，and a high circulating miR-106a expression level is an independent risk factor for poor prognosis of HCC patients.

circulating；miR-106a/b；hepatocellular carcinoma；diagnosis；prognosis

R735.7

A

0258-4646（2017）09-0830-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170906.1318.028.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.09.014

唐津天（1981-），男，主治医师，博士研究生.

唐津天，E-mail：tangjintian120@163.com

2017-01-12

网络出版时间：2017-09-06 13:18