高效液相色谱法测定利伐沙班中的有关物质

2017-09-20黄艳陈雪云杨雪峰

中国当代医药 2017年24期

黄艳+陈雪云+杨雪峰

[摘要]目的建立利伐沙班的有关物质测定方法。方法采用高效液相色谱法，色谱柱为Diamonsil C8（250 mm×4.6 mm，5 μm），以5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.3%的25%四甲基氢氧化铵溶液，用冰醋酸调pH至4.8）-乙腈（80∶20）为流动相A，以5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.3%的25%四甲基氢氧化铵溶液，用冰醋酸调pH至4.8）-乙腈（10∶90）为流动相B，梯度洗脫，检测波长为250 nm。结果利伐沙班与相邻杂质峰以及各杂质峰之间的分离度均>2.0，检测限为0.2～0.5 ng，定量限为1.0～2.0 ng。结论该方法适用于利伐沙班有关物质的测定。

[关键词]高效液相色谱法；利伐沙班；有关物质；测定

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）08（c）-0078-04

[Abstract]Objective To establish a method to determine the related substance in Rivaroxaban.Methods HPLC method was used，column was Diamonsil C8 （250 mm×4.6 mm，5 μm），the mobile phase A was treated with 5 mmol/L ammonium acetate solution （containing 0.3% 25% tetramethyl ammonium hydroxide solution，adjusted to pH 4.8 with glacial acetic acid）-acetonitrile （80∶20），the mobile phase B was treated with 5 mmol/L ammonium acetate solution （containing 0.3% 25% tetramethyl ammonium hydroxide solution，pH was adjusted to 4.8 with glacial acetic acid）-acetonitrile （10：90），which was used as gradient elution The detection wavelength was 250 nm.Results The resolution of rivaroxaban and its related substance was above 2.0，detection limit was 0.2-0.5 ng，quantification limit was 1.0-2.0 ng.Conclusion The method is suitable for the determination of related substance in Rivaroxaban.

[Key words]HPLC；Rivaroxaban；Related substance；Determination

利伐沙班（Rivaroxaban）是一种Xa因子抑制剂，对Xa因子具有高度的选择性[1-5]，于2008年在加拿大首先上市，用于髋或膝关节置换术后静脉血栓栓塞症的预防，有极好的体内活性和生物利用度，是可以口服的新型抗凝药，具有良好的应用前景[6-13]。根据利伐沙班的合成工艺，可能存在的有关物质有乙酰草酰胺（杂质A）、二-草酰胺-尿素（杂质B）、脱氯化合物（杂质C）、氧代邻苯二甲酰亚胺（杂质D）、4，5-二氯化合物（杂质E）、二胺（杂质F）和三胺（杂质G）等。为了保证药品的安全性，现对自制的利伐沙班原料药有关物质测定方法进行研究，建立了高效液相色谱法（HPLC）不加校正因子的主成分自身对照法测定利伐沙班的有关物质。该方法准确、简便，能有效控制利伐沙班的质量。

1仪器与试药

岛津LC-2010AHT液相色谱仪，乙腈为色谱纯，水为双蒸水，乙酸铵、25%四甲基氢氧化铵、冰醋酸均为分析纯，利伐沙班（自制，批号为20140801、20140901、20140902），利伐沙班对照品（MedChem Express，批号为03201），杂质A、B、C、D、F对照品均购自Cato Research Chemicals Inc，杂质E、G对照品均购自Quality Control Chemicals Inc。

2方法与结果

2.1溶液的配制

精密称取利伐沙班适量，加溶剂[流动相A-流动相B（4∶1）]超声溶解并稀释制成每1毫升中约含0.4 mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1 ml，置50 ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取1 ml，置20 ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

2.2色谱条件与系统适用性试验

采用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.3%的25%四甲基氢氧化铵溶液，用冰醋酸调pH至4.8）-乙腈（80∶20）为流动相A，以5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.3%的25%四甲基氢氧化铵溶液，用冰醋酸调pH至4.8）-乙腈（10∶90）为流动相B，梯度洗脱（0～20 min，90% A；20～40 min，90% A→50% A；40～60 min，50% A；40～61 min，50% A→90% A；41～75 min，90% A）；检测波长为250 nm；柱温30℃；流速1.0 ml/min。分别精密称取利伐沙班及杂质A、B、C、D、E、F、G对照品适量，分别加溶剂溶解并制成各对照品溶液及混合溶液；精密量取上述溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，混合溶液结果见图1。理论塔板数按利伐沙班主峰计算为68 877，利伐沙班与相邻杂质峰以及各杂质峰之间的分离度均>2.0。endprint

2.3进样精密度

取“2.2”项下的混合溶液20 μl注入液相色谱仪，连续进样6次测定，结果各色谱峰面积的RSD均<2.0%（利伐沙班RSD=1.16%、杂质A RSD=0.52%、杂质B RSD=0.44%、杂质C RSD=0.36%、杂质D RSD=1.15%、杂质E RSD=0.67%、杂质F RSD=0.62%、杂质G RSD=0.39%），提示该方法的进样精密度良好。

2.4专属性试验

精密称取利伐沙班约20 mg，共6份，分别置50 ml量瓶中，按以下条件试验：一份加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀；一份加0.3%的过氧化氢溶液2 ml，摇匀，室温放置2 h，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀；一份加1 mol/L盐酸溶液2 ml，摇匀，室温放置2 h，用1mol/L氢氧化钠溶液2 ml中和，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀；一份加1 mol/L氢氧化钠溶液2 ml，摇匀，室温放置2 h，用1 mol/L盐酸溶液2 ml中和，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀；一份加溶剂适量，置沸水浴中加热2 h，取出，放冷至室温，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀；一份于（4500±500）lx照射5 d，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取上述6种溶液各20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图2。

2.5检测限和定量限

分别精密称取利伐沙班及杂质A、B、C、D、E、F、G对照品适量，分别加溶剂溶解并稀释制成每1毫升中约含利伐沙班5 μg的溶液，分别逐级稀释，取20 μl注入液相色谱仪，经分析，利伐沙班的检测限为0.5 ng（S/N≈3）、定量限为2.0 ng（S/N≈10），杂质A的检测限为0.3 ng（S/N≈3）、定量限为1.0 ng（S/N≈10），杂质B的检测限为0.2 ng（S/N≈3）、定量限为1.0 ng（S/N≈10），杂质C的检测限为0.3 ng（S/N≈3）、定量限为1.0 ng（S/N≈10），杂质D的检测限为0.3 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10），杂质E的检测限为0.2 ng（S/N≈3）、定量限为1.0 ng（S/N≈10），杂质F的检测限为0.3 ng（S/N≈3）、定量限为1.0 ng（S/N≈10），杂质G的检测限为0.3 ng（S/N≈3）、定量限为1.0 ng（S/N≈10）。

2.6线性关系试验及校正因子的测定

分别精密称取利伐沙班及杂质A、B、C、D、E、F、G对照品适量，分别加溶剂溶解并稀释成每1 毫升中约含各组分1 μg的溶液，分别精密量取该溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0置10 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，分别取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度（μg/ml）对峰面积作标准曲线，线性回归方程、校正因子等结果见表1。校正因子的测定显示，各杂质的校正因子均没有超出0.9～1.1的范围，可直接采用不加校正因子的主成分自身对照法进行限量检查。

2.7溶液稳定性试验

取批号为20140901的供试品溶液，分别放置0、1、2、4、6、8、12、16、20、24 h后测定，结果主峰峰面积的RSD=0.76%，各杂质峰峰面积的RSD均<2.0%（杂质A RSD=1.06%、杂质B RSD=0.71%、杂质C RSD=0.64%、杂质D RSD=1.84%、杂质E RSD=1.62%、杂质F RSD=0.92%、杂质G RSD=1.23%、总杂质RSD=0.59%），提示供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.8供试品有关物质检查

取3批供试品，按照“2.1”项下的方法制备溶液，按照“2.2”项下的色谱条件，采用不加校正因子的主成分自身对照法测定有关物质，结果见表2。

3讨论

3.1检测波长的选择

分别精密称取利伐沙班及杂质A、B、C、D、E、F、G对照品适量，分别加溶剂溶解并稀释制成每1毫升中约含各对照品10 μg的溶液，按照分光光度法[14-15]于190～400 nm波长范围内扫描，利伐沙班及杂质A、B、C、D、E、F、G均在250 nm波长处有最大吸收，参照利伐沙班片进口注册标准，将有关物质检测波长确定为250 nm[16]。

3.2色谱条件优化

实验过程中发现，将乙酸铵溶液与乙腈线下预先混合能改善基线漂移；另外，在流动相中加入四甲基氢氧化铵能有效地改善拖尾，提高分离度。

3.3专属性试验

利伐沙班在高温、强光及氧化条件下杂质均无明显变化，且未产生新的降解杂质；在强碱破坏条件下，杂质B、杂质C及相对保留时间0.714处有所增加，其他杂质均无明显变化；酸破坏条件下，杂质C及相对保留时间0.714处未知杂质有所增加，其他杂质均无明显变化，欲知此未知杂质具体是什么物质，还有待进一步研究。另外，通过安捷伦色谱工作站提供的“全波长法”分析以上色谱图中，利伐沙班纯度指数值均>0.990，提示主峰均为单一物质峰，且降解产物峰、已知杂质峰均与主峰的分离度满足检测要求。

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