星点设计-响应面优选颈痛颗粒提取工艺研究

李 毅，杨全伟

武汉市第一医院(湖北 武汉 430000)

星点设计-响应面优选颈痛颗粒提取工艺研究

李 毅，杨全伟*

武汉市第一医院(湖北 武汉 430000)

目的优选颈痛颗粒中葛根素和芍药苷的提取工艺，为该制剂的资源开发提供参考。方法在单因素试验基础上，以葛根素和芍药苷提取量的综合评分为指标，根据Box-Benhnken中心组合设计原理，利用响应面分析法考察料液比、提取次数、提取时间对颈痛颗粒中葛根素和芍药苷提取工艺的影响。结果最佳提取工艺为加8.8倍量水，提取2次，每次提取1.5 h。葛根素、芍药苷提取量分别为4.703 mg/mL，2.536 mg/mL，综合评分95.33分，与预测值(98.58分) 的相对误差 3.3%。结论通过响应面法优选的颈痛颗粒提取工艺合理可行，提取率高，易于工业化大生产，为该制剂的开发应用提供实验依据。

颈痛颗粒；葛根素；芍药苷；提取工艺

颈痛颗粒是由葛根、白芍、续断、当归、川芎、桂枝、甘草等十味药材组成，对颈椎疼痛有很好的治疗作用，其中葛根素和芍药苷是颈痛颗粒的主要活性物质[1-3]。本研究采用星点设计-响应面法对该处方进行水回流提取工艺研究，以葛根素和芍药苷提取量为考察指标，优选颈痛颗粒最佳提取工艺条件。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪；赛多利斯电子天平(Max210 g,d=0.01 mg)。颈痛颗粒处方药材(购自安徽亳州)。葛根素(批号110752-201505)，芍药苷(购自于中国食品药品检定研究院，批号110736-201407)；甲醇(色谱纯)，水为双重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：安捷伦ExtengC18柱(200 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相：甲醇-水(25∶75)，流速：1.0 mL/min，柱温：25℃，检测波长：250 nm，进样量20 μL[4-6]。

2.2溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 分别精密称取葛根素和芍药苷对照品适量，置于100 mL量瓶中，加30%乙醇定容至刻度，摇匀，制成浓度分别为0.14 mg/mL和0.10 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 称取颈痛颗粒处方药材，加10倍水进行提取，提取2次，每次提取1 h，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至200 mL。精密量取提取液1 mL，置50 mL量瓶中，加30%乙醇定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液后，即得。

2.2.3 阴性供试品溶液的制备 取缺葛根、白芍药材的其余药材，按供试品溶液制备，即为阴性供试品溶液。

3 方法学考察

3.1专属性考察分别吸取葛根素和芍药苷混合对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液进样检测，对照品溶液与供试品溶液在对应的时间出现了葛根素吸收峰和芍药苷吸收峰，阴性溶液无干扰，见图1

A：对照品；B：供试品；C：阴性样品；1：葛根素；2：芍药苷。图1 颈痛颗粒高效液相色谱图

3.2线性关系考察分别精密吸取葛根素和芍药苷混合对照品溶液1、2、4、8、16、20 mL，分别置于25 mL量瓶中，加30%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得，按上述色谱条件进行测定，分别进样20 μL，分别以葛根素、芍药苷的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，计算得葛根素回归方程为Y=4.141 04X-1 189.37(r=0.999 6)，结果表明葛根素在0.005 6～0.112 mg/mL范围内线性关系良好；计算得芍药苷回归方程为Y=3.171 03X-1 924.06(r=0.999 8)，结果表明芍药苷在0.004～0.080 mg/mL范围内线性关系良好。

3.3精密度试验取上述混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，计算得葛根素和芍药苷的峰面积(RSD)为0.74%、0.88%，表明仪器精密度良好。

3.4稳定性试验取供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样，计算得葛根素和芍药苷RSD值为1.17%、1.25%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.5重复性试验精密量取同一供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件，分别进样检测，计算葛根素、芍药苷平均含量分别为4.72 mg/mL、2.52 mg/mL、RSD分别为1.88%、1.66%，表明该方法的重复性良好。

3.6加样回收率试验分别精密称定同一供试品溶液6份，精密量取1 mL，分别置于100 mL量瓶中，加入适量的葛根素和芍药苷对照品，加30%的乙醇定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液即得，进样检测，计算回收率，结果葛根素、芍药苷平均回收率分别为100.01%、98.85%，RSD分别为1.82%、1.44%。

4 响应面试验

以料液比、提取时间和提取次数为自变量，以葛根素和芍药苷提取量为考察指标进行综合评分，权重系数为50%，按表1 设计方案进行水加热回流提取，所得药液，分别减压浓缩至200 mL，按供试品方法制备，进样检测，见表1。

采用 Design-Expert 分析软件进行二次多项式逐步回归拟合，得各自变量与综合评分之间的回归方程：

R=97.82+5.29A+2.48B+1.79C+1.63AB-1.16AC-10.37A2-8.92B2-1.57C2( r=0.982 8)，该方程具有显著性，对方程进行回归方差分析，见表2。结果X1、X12、X22对综合指标的影响极显著，交互项X1X2，X1X3的影响不显著；失拟项影响不显著，无统计学意义，说明该回归方程拟合度良好，回归模型P<0.000 1，说明选用的二次多项模型有显著性，所得回归方程可以很好的反应考察指标与各自变量的关系[7-9]。

表1 颈痛颗粒中葛根素和芍药苷提取工艺Box-Behnken试验分析

表2 响应面模型方差分析

4.1工艺条件优选根据上述回归方程，采用Design-Expert分析软件进行3D响应面的绘制及等高线的绘制，见图2。经Design-Expert软件优化得颈痛颗粒的最佳提取工艺为料液比1∶79，提取数1.6次，提取时间1.56 h。考虑实际生产提取次数为整数，最佳工艺调整为料液比1∶8.8，提取数2次，提取时间1.5 h。

A：葛根素；B：芍药。图2 提取率星点设计响应面图

4.2三批验证称取颈痛颗粒处方药材3份，分别加8.8倍量水煎煮2次，每次1.5 h，所得药液减压浓缩至200 mL，按上述色谱条件进行检测，测定葛根素和芍药苷平均提取量分别为 4.703 mg/mL，2.536 mg/mL，RSD分别为2.1% 和1.9% 。综合评分为95.33分，与预测值(98.58分)相对误差 3.3%，说明优选的提取工艺参数准确，稳定。

5 讨论

颈痛颗粒是在《伤寒论》中葛根汤的基础上加减化裁而成，对神经根型颈椎病(CSR)具有很好的临床疗效，弥补了传统手术治疗CSR创伤大、费用贵、复发率高的缺点。通过中医理论结合现代中药药理的基础研究组方，经过规范的临床观察实验研究，获得有效低廉、安全可靠和患者依从性好的中药组方并开发成方便易于服用的中药成药，符合中国现代中医药发展的要求，具有广阔的应用前景。

颈痛颗粒提取工艺一般以君药中葛根素为评价指标，如果仅以 1 个成分作为检定指标，存在局限性。本文以葛根素和芍药苷为指标成分，使测定指标更趋于合理，结果更科学、准确，能更好地控制颈痛颗粒的药材品质[10]。本文采用星点设计响应面法对试验因素的各个水平进行了分析，克服了正交试验只能对孤立的点进行分析的缺点，得到了最佳提取工艺参数，具有精确度高、模型预测性好的优点。

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StudyonOptimizationofNeckPainParticlesExtractionwithCentralCompositeDesign-responseSurfaceMethodology

Li yi，Yang Quanwei*

(WuhanNO.1Hospital,Wuhan430000,China)

ObjectiveTo optimize extraction process of Puerarin and Paeoniflorin for neck pain particles.MethodsBased on single factor tests and regarded the Puerarin and Paeoniflorin extraction amount as scoring index,the effects of solid-to-liquid ratio,extraction times and duration to extracting Puerarin and Paeoniflorin for Neck pain particles were investigated by response surface analysis method,according to Box-Behnken design principles.ResultsThe best extraction process of Puerarin and Paeoniflorin was adding 8.8 times liquid,reflux extracting for twice,1.5 hours for each time.Yields of Puerarin and Paeoniflorin were 4.703,2.536 mg·mL-1respectively.The comprehensive score was 95.33,and there was relative error 3.3% in comparison with the predicted value.ConclusionThis process is reasonable and feasible with high extraction rate,and practical for massive industrial production.This study can provide experimental basis for further development of neck pain particles.

neck pain particles;puerarin;paeoniflorin;extraction process

李毅，男，本科，药师，研究方向：中药提取及制剂研究。*

杨全伟，男，硕士，主管中药师，主要从事中药新制剂新剂型等方面的研究

R284.2

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1008-8164(2017)03-0030-03

2017-05-04责任编辑：艾茜