红花水煎液对博莱霉素诱导的系统性硬化症小鼠肺组织胶原及羟脯氨酸含量的影响

胡谋波，吕军影

1.湖北民族学院附属荆门市第一人民医院风湿科(湖北 荆门 448000)2.广西医科大学第一附属医院中医科(广西 南宁 530021)

红花水煎液对博莱霉素诱导的系统性硬化症小鼠肺组织胶原及羟脯氨酸含量的影响

胡谋波1，吕军影2*

1.湖北民族学院附属荆门市第一人民医院风湿科(湖北 荆门 448000)2.广西医科大学第一附属医院中医科(广西 南宁 530021)

目的观察红花水煎液对博莱霉素诱导的系统性硬化症(SSc)小鼠肺组织胶原及羟脯氨酸(HYP)含量的影响。方法BALB/C小鼠共32只，随机分为空白对照组、模型对照组、醋酸泼尼松组及红花水煎液组，每组各8只。除空白对照组外，其余各组均采用博莱霉素建立SSc小鼠模型，建模同时各组给予对应药物灌胃。建模后第28 d处死小鼠，取左肺制成石蜡切片进行Sirius Red染色，使用Image-pro-plus 6.0测定Sirius Red染色胶原含量，取右肺按试剂盒说明书测定HYP的含量。结果与空白对照组比较，各组小鼠肺组织胶原及HYP含量均明显升高(P<0.05)；在使用醋酸泼尼松混悬液和红花水煎液治疗后，小鼠肺组织胶原及HYP含量较模型对照组显著降低(P<0.05)。结论红花水煎液能减少博莱霉素诱导的SSc小鼠肺组织胶原及HYP含量，其机制可能通过抑制肺组织胶原的沉积，从而有效防治SSc肺纤维化。

红花；肺组织；系统性硬化症；胶原；羟脯氨酸；小鼠

系统性硬化症(systemic scleroderma,SSc)是一种侵犯皮肤和全身多个内脏器官(包括肺、食道、胃肠道、心脏、肾脏等) 的结缔组织疾病，最常累及的器官是肺和食道。其主要特点是成纤维细胞增殖、胶原合成增多和堆积，引起皮肤和内脏器官纤维化[1]。本病目前尚无有效的根治和缓解病情进展的药物，临床可使用的较多，但疗效往往不理想[2]。目前中医药治疗SSc方法多，疗效肯定，已受到国内外医学界普遍重视[3]。本实验通过复制SSc小鼠模型，观察肺组织胶原及羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量的变化，探讨中药红花治疗SSc肺纤维化可能的机制，为中医药抗SSc组织纤维化提供实验依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验药物注射用盐酸博莱霉素(日本化药株式会社，生产批号440392)，规格15 mg(效价)/瓶(以博莱霉素计)，用高压灭菌后的pH=7.2磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，配成200 μg/mL的博莱霉素磷酸盐缓冲液，4 ℃保存备用。醋酸泼尼松片(广东华南药业集团有限公司，批号150301)，每片5 mg，蒸馏水溶解配成0.45 mg/mL混悬液，4 ℃保存备用。红花(南宁生源中药饮片有限责任公司，批号140901)，煎药前用蒸馏水浸泡30 min，置于不锈钢容器中以中火煎煮30 min，干净纱布过滤倒出药液，再次加入蒸馏水将药渣煎煮30 min后滤出药液。混合2次药液以小火浓缩，使药液质量分数达到0.15 g/mL，离心后取上清液，4 ℃保存备用。

1.2实验试剂与仪器Sirius Red染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号20160413)；HYP试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20160409)；电子天平；双光束紫外线分光光度计(美国PekinElmer公司)；电热恒温水浴箱(上海精宏实验设备有限公司)；高速冷冻多用途离心机(德国Eppendorf公司)；Olympus正置荧光显微镜(日本Olympus，型号BX53)。

1.3实验动物32只健康BALB/C小鼠，雌性，清洁级，体质量(20±2)g，由广西医科大学动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK桂2014-0002。于实验前2 d一次性购进，按清洁级标准饲养于安静、恒温、恒湿的环境中，自由饮水进食。

1.4建立SSc模型适应性喂养2 d后将小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、醋酸泼尼松组、红花水煎液组，每组各8只。除空白对照组外，其余各组采用博莱霉素皮下注射建立小鼠SSc模型。按照参考文献[4-6]方法剔除小鼠背部中央区被毛，面积大小约1.5 cm×1.5 cm，使用1 mL无菌注射器在被毛剔除部位皮下注射，空白对照组给予PBS 0.1 mL，其余各组给予博莱霉素磷酸盐缓冲液0.1 mL，每组均为1次/d，连续注射28 d。

1.5给药方法建模同时给予药物灌胃，空白对照组和模型对照组给予生理盐水0.2 mL/d灌胃，醋酸泼尼松组和红花水煎液组按照每千克体质量占体表面积的相对比值与人所需剂量换算[7](醋酸泼尼松量0.09 mg/d，红花30 mg/d)，分别给予等体积的醋酸泼尼松混悬液和红花水煎液灌胃，每组均为1次/d，连续给药28 d。

1.6标本采集及处理建模28 d后结束实验，腹腔注射麻醉后处死所有小鼠，采集左肺制成石蜡切片，进行Sirius Red染色；采集右肺置于冻存管中，-80 ℃保存，供检测使用。

1.7SiriusRed染色肺组织胶原纤维含量测定采用美国Image-pro-plus 6.0专业图像分析软件进行定量分析，每个组织随机选取6个不重复的阳性表达视野(×200)，Sirius Red染色阳性表达为红色胶原沉积，计算每个视野中阳性表达面积与肺组织面积的比值，并取平均值。

1.8肺组织HYP含量测定严格按照试剂盒操作步骤采用样本碱水解法检测肺组织HYP含量。用分光光度计(波长为550 nm)测出OD值，根据公式计算HYP含量。

2 结果

2.1各组小鼠肺组织Sirius Red染色病理形态变化比较空白对照组显示正常肺组织结构，无明显炎症渗出及红色胶原纤维形成。模型对照组肺组织结构几乎消失，绝大部分肺泡破坏、萎缩，肺泡间隔增厚，大量红色胶原纤维形成。醋酸泼尼松组和红花水煎液组可见成纤维细胞和胶原纤维数量增加，但与模型对照组比较，纤维化程度明显减轻，见图1。

A:空白对照组;B:模型对照组;C:醋酸泼尼松组;D:红花水煎液组。图1 各组小鼠肺组织Sirius Red染色病理形态变化(×200)

2.2各组小鼠肺组织胶原和HYP含量比较空白对照组肺组织有少量胶原和HYP存在；与空白对照组比较，其余各组小鼠肺组织胶原和HYP含量升高(P<0.05)，模型对照组尤为显著(P<0.05)；经治疗后醋酸泼尼松组和红花水煎液组胶原和HYP含量较模型对照组均明显下降(P<0.05)，但两组之间胶原和HYP含量无显著性差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组小鼠肺组织胶原和HYP含量比较

注：与空白对照组比较，*:P<0.05；与模型对照组比较，#:P<0.05。

3 讨论

肺组织纤维化是SSc常见的一种肺损害，也是SSc主要死亡原因之一[8]。肺纤维化目前尚无有效的根治或缓解药物，临床最常用的是糖皮质激素，还包括免疫抑制剂和抗纤维化治疗药物，但这些药物副作用明显，同时疗效及安全性也存在一定争议[9]。红花(CarthamustinctoriusL)是一种常见的活血化瘀类中药[10]，具有抗血小板聚集、抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用[11]。国内研究[12]报道红花对多个组织器官具有抗纤维化作用。孙时华等[13]建立大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型，采用免疫组化检测肾组织中I型胶原(COL-I)和纤维连接蛋白(FN) 的表达，发现红花黄色素下调肾组织中COL-I和FN的表达，抑制细胞外基质在肾间质的沉积，具有延缓肾小管损伤及肾纤维化的作用。李伟镇等[14]发现红花总黄素能降低四氯化碳致肝纤维化大鼠透明质酸(HA) 、层粘连蛋白(LN) 、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ) 和Ⅳ型胶原(C-Ⅳ) 含量，具有抗肝纤维化作用。宋远瑛等[15]在常规西医治疗的基础上加用红花黄色素注射治疗特发性纤维化，结果显示患者动脉血气、肺功能较常规治疗组明显好转，表明红花黄色素临床辅助治疗具有改善特发性肺纤维化的作用。梁娟等[16]认为红花可抑制IL-17、IL-6的表达起到抗皮肤纤维化作用。红花抗纤维化作用及其机制研究仍处于初级阶段，仍有很多工作有待深入。但是，越来越多的证据表明红花抗纤维化作用具有广阔的前景，具有极大的研究价值。

SSc实验动物模型有多种建立方法，包括用紧皮鼠、UCD鸡、C3H小鼠、新西兰兔、BALB/C小鼠等作为SSc模型[17]。近年来， 国内外研究者大多都选用浓度200 μg/mL的博莱霉素皮下注射诱导BALB/C小鼠建立SSc动物模型，该模型与临床SSc在组织病理改变和免疫组织化学方面类似，而且建模操作简单，重复性好，得到了普遍肯定。组织纤维化是成纤维细胞数量增多，合成胶原纤维增多导致胶原过度沉积的病理过程。HYP是一种在胶原中含量较多的非必须氨基酸，是胶原的特征性成分之一，因此，测定HYP的含量能确定组织中胶原的含量，能较客观地反映组织纤维化程度及抗纤维化药物治疗效果。

本组实验结果表明，模型对照组胶原和HYP含量显著升高(P<0.05)，在应用醋酸泼尼松和红花水煎液治疗后，肺组织胶原和HYP含量较模型对照组下降(P<0.05)，表明醋酸泼尼松和红花水煎液一定程度上可抑制胶原沉积和HYP变化。因此认为，红花能有效降低SSc小鼠肺组织HYP含量，抑制胶原形成，这可能是红花治疗SSc肺纤维化的机制之一。

[1] 胡谋波,吕军影.红花水煎液对博莱霉素诱导的硬皮病小鼠肺组织胶原含量的影响[J].风湿病与关节炎,2016,5(9):5-8.

[2] 中华医学会风湿病学分会.系统性硬化病诊断及治疗指南[J].中华风湿病学杂志,2011,15(4)：256-259.

[3] 陈曦,张润田,段行武.中医治疗硬皮病研究进展[J].中国麻风皮肤病杂志,2013,29(5):331-333.

[4] Yamamoto T.The bleomycin-induced scleroderma model:what have we learned for scleroderma pathogenesis?[J].Arch Dermatol Res,2006,297(8):333-344．

[5] Yamamoto T.Animal model of systemic sclerosis[J].Journal of Dermatology，2010,37(1):26-41．

[6] 陆晓凤,罗婧莹.硬皮病动物模型建模药物最适浓度探讨[J].中国现代医学杂志,2016,26(1):1-4.

[7] 章元沛,苏怀德.药理学实验[M].第2版.北京:人民卫生出版社,1996:238-240.

[8] Winstone TA,Assayag D,Wilcox PG,et al.Preditors of morality and progression in Sclerorderma-associated interstitial lung disease:a systematic review[J].Chest,2014,146(2):422-436.

[9] 潘有禄,黄文海,沈正荣,等.肺纤维化发生机制及治疗研究进展[J].中国药学杂志,2012,47(23):1 873-1 876.

[10] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:141.

[11] 朱莉红.红花药理分析及临床应用分析[J].中国现代药物应用,2016,10(16):286-287.

[12] 胡谋波,郑雪嘉,梁娟,等.中药红花抗纤维化机制研究进展[J].湖北民族学院学报·医学版,2016,33(1):66-68.

[13] 孙时华,严富华,姜建军,等.红花黄色素对单侧输尿管梗阻大鼠模型肾间质纤维化的影响[J].中华中医药学刊,2010,28(4):891-893.

[14] 李伟镇,张旭红,黄清松.红花总黄素对肝纤维化大鼠肝功能和相关血清指标的影响[J].江西中医药,2014,45(10):46-48.

[15] 宋远瑛,李树岗.红花黄色素对于特发性肺纤维化患者生活质量改善的临床研究[J].中国药物经济学,2013，8(7):72-73.

[16] 梁娟,祁承林,胡谋波,等.红花水煎液对系统性硬皮病小鼠皮肤及肺组织纤维化的影响及机制[J].山东医药,2016,56(12):16-19.

[17] Yamamoto T,Nishioka K.Cellular and molecular mechanisms of bleomycin-induced murine scleroderma:current update and future perspective[J].Exp Dermatol,2005,14(2):81-95.

StudyonEffectsofSafflowerDecoctiononCollagenContentandHydroxyprolineofLunginBleomycin-inducedRatwithSystemicScleroderma

Hu Moubo1,Lü Junying2*

(1.TheDepartmentofRheumatism,JingmenNo.1People’sHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityForNationalities,Jingmen448000,China;2.TheDepartmentofTraditionalChineseMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

ObjectiveTo study the effects of safflower decoction on collagen content and hydroxyproline(HYP) of lung in bleomycin-induced rat with systemic scleroderma.Methods32 BALB/C rats were randomly divided into 4 groups:blank control group,model group,prednisone acetate group and safflower decoction group (8 rats in each group).Except the blank control group,the other 3 groups were used to establish rat models with systemic scleroderma by bleomycin;meanwhile,rats in the 3 groups were given intragastric administration with corresponding drugs.All the 3 groups of rats were executed,28 days after modeling.Rats’paraffin sections from the left lung were used for Sirius Red staining.Sirius Red staining collagen content was determined by Image-pro-plus 6.0 image analysis software,and the right lungs were used to determine the content of HYP according to kit instructions.ResultsCompared with the blank control group,the collagen content and the HYP content in the lung tissue of rats in each group significantly increased(P<0.05).After treatment with prednisone acetate suspension and safflower decoction,the collagen content and the HYP content in the lung tissue of rats significantly decreased (P<0.05).ConclusionThe Safflower edecoction can efficiently decrease the lung collagen content and the HYP content in bleomycin-induced rats with systemic scleroderma,which may be carried out by inhibiting the deposition of collagen in lung tissue,so as to effectively prevent and treat systemic scleroderma pulmonary fibrosis.

safflower;lung tissue;systemic scleroderma;collagen;hydroxyproline;rats

广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项课题(GZPT1239)。

胡谋波，男，硕士，医师，研究方向：中西医结合治疗风湿疾病的基础与临床研究。*

吕军影，女，硕士，硕士研究生导师，主任医师，主要从事中西医结合治疗风湿疾病的临床和基础研究。

R285.5

A

1008-8164(2017)03-0010-04

2017-04-12责任编辑：艾茜