反向高效液相色谱法同时测定祛斑养阴颗粒中橙皮苷和黄芩苷的含量

杨全伟，肖 柳

1.武汉市第一医院(湖北 武汉430000)2.武汉市中医医院(湖北 武汉430000)

反向高效液相色谱法同时测定祛斑养阴颗粒中橙皮苷和黄芩苷的含量

杨全伟1，肖 柳2*

1.武汉市第一医院(湖北 武汉430000)2.武汉市中医医院(湖北 武汉430000)

目的建立高效液相色谱法同时测定祛斑养阴颗粒中橙皮苷和黄芩苷的含量测定方法。方法采用色谱柱为依利特SinoChrom ODS-BPC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱;流速：1.0 mL/min;柱温：30℃; 检测波长：220 nm;流动相：乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱(0～12 min，5%A→10%A；12～25 min，10%A→25%A；25～35 min，25%A→35%A)。结果橙皮苷回归方程为Y1=12 147.47 X1-4 728.96，r=0.999 8，表明橙皮苷在0.243 ～2.43 μg范围内线性关系良好。黄芩苷回归方程为Y2=27 986.68 X2-5 324.71，r=0.999 9，表明黄芩苷在0.357～3.57 μg范围内线性关系良好。结论本试验所建立的方法简单可行，快速简便，重复性好，可以作为祛斑养阴颗粒的质量控制。

祛斑养阴颗粒；黄芩苷；橙皮苷；高效液相色谱法

祛斑养阴颗粒为武汉市第一医院皮肤科协定处方，由黄芩、黄芪、陈皮、党参、当归等12味中药组成，具有益气养血、清热解毒，祛风退斑的功效。方中黄芩为君药，黄芪、陈皮为臣药，祛斑养阴颗粒制剂成分繁多，仅用单一的成分测定含量不能完整的反应和控制制剂的质量，为了更好地控制祛斑养阴颗粒的质量，本实验以祛斑养阴颗粒中的黄芩、陈皮为研究对象，通过高效液相色谱法测定制剂中橙皮苷、黄芩苷的含量，为该制剂的有效成分测定和质量标准研究提供依据，现报道如下。

1 材料

1.1仪器Waters e2695高效液相色谱仪(Waters 2489紫外检测器，四元泵，自动进样器，柱温箱)；BP211D电子天平(德国赛多利斯公司，Max 210 g,d=0.01 mg)。

1.2试药橙皮苷(中国食品药品检定研究院，批号110721-200211)，黄芩苷(中国食品药品检定研究院，批号110715-201016)；祛斑凝胶自制(由武汉市第一医院制剂中心，批号170410，170411，170412)；乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司)；纯化水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件色谱柱为依利特SinoChrom ODS-BPC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：220 nm；流动相：乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱(0～12 min，5%A→10%A；12～25 min，10%A→25%A；25～35 min，25%A→35%A)[1-3]。

2.2对照品溶液制备分别精密称取减压干燥至恒重的橙皮苷和黄芩苷对照品适量至100 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，作为对照品贮备液，分别精密吸取上述各对照品贮备液适量至同一容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀即得混合对照品溶液，浓度分别为橙皮苷121.5 μg/mL、黄芩苷178.5 μg/mL[4-6]。

2.3供试品溶液制备取祛斑养阴颗粒(武汉市第一医院制剂中心，批号170410)1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定重量，超声提取30 min，放冷，用70%甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液即得[7]。

2.4阴性样品溶液按祛斑养阴颗粒的处方比例与制备工艺分别制备缺陈皮、酒黄芩的阴性样品，按“2.3”项下方法制备各阴性样品溶液。

2.5专属性考察按“2.1”项下色谱条件，分别取上述混合对照品溶液、供试品溶液和各阴性样品溶液，分别进样20 μL，分别记录色谱图(见图1)。在色谱图中，对照品溶液和供试品溶液的待测成分在保留时间上一致，峰形好，分离度好，无干扰，阴性样品溶液在特征峰处无干扰，表明此方法的专属性好。

2.6方法学考察

2.6.1 线性关系考察 精密吸取上述混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别自动进样2、4、8、12、16、20 μL记录色谱图，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标计算线性回归方程，橙皮苷回归方程为Y1=12 147.47 X1-4 728.96，r=0.999 8，表明橙皮苷在0.243～2.43 μg范围内线性关系良好。黄芩苷回归方程为Y2=27 986.68 X2-5 324.71，r=0.999 9，表明黄芩苷在0.357～3.57 μg范围内线性关系良好。

A:混合对照品；B:供试品；C:陈皮阴性样品；D:酒黄芩阴性样品；1:橙皮苷；2:黄芩苷。图1 祛斑养阴颗粒HPLC色谱图

2.6.2 精密度试验 精密吸取上述混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续自动进样6次，每次20 μL，记录色谱图，橙皮苷和黄芩苷，峰面积RSD值分别为0.48%、0.59%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 取祛斑养阴颗粒按“2.3”项下制备供试品溶液1份，室温下放置，按“2.1”项下的色谱条件分别于0、4、8、16、20、24 h各进样20 μL，记录色谱图，计算橙皮苷和黄芩苷的峰面积RSD值分别为0.79%、1.08%，表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.6.4 重复性试验 取同一批号祛斑养阴颗粒(批号170410)6份，按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进行测定，记录色谱图，计算各成分平均含量，结果橙皮苷0.84 mg/mL和黄芩苷3.16 mg/mL，RSD分别为1.39%、1.16%，表明该方法的重复性良好。

2.6.5 加样回收率试验 称取已知含量的祛斑养阴颗粒(批号170410)6份,各0.5 g，精密称定，分别置于锥形瓶中,分别加入橙皮苷对照品溶液、黄芩苷对照品溶液适量，加70%甲醇44 mL，称定重量，超声提取30 min，放冷，用70%甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积，计算各成分的加样回收率。结果橙皮苷、黄芩苷平均回收率分别为100.23%、99.71%，RSD分别为0.67%、0.52%,见表1。

表1 加样回收率试验

2.7 3批样品含量测定取3批不同批号(批号170410、170411、170412)的祛斑养阴颗粒，按“2.2.2”项方法制备，按“2.1”项色谱条件进行测定，记录峰面积，分别计算橙皮苷、黄芩苷的含量，见表2。

表2 3批样品含量测定结果(mg/g)

3 讨论

中药成分复杂，若仅选用单一成分对制剂质量进行控制，与中医整体论治的观点不符，故选择君药黄芩中黄芩苷的含量和臣药陈皮中橙皮苷的含量制定方法学实验。

本实验通过参考文献及全波长扫描，选择2种检测成分紫外吸收波长在220 nm有共同的最大吸收波长，故选择紫外波长为220 nm[8]。本实验考察了甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-水、乙腈-水等体系进行梯度洗脱，并对流动相条件进行优化，结果表明，流动相为乙腈-0.1%磷酸水时，峰形较好，可以达到基线分离，无干扰。本实验在进行含量测定中,选择的紫外波长接近于末端吸收,而2015版《中国药典》规定黄芩中黄芩苷的紫外吸收波长为280 nm[9]，陈皮中橙皮苷规定紫外吸收波长为283 nm[10]，本实验采用紫外波长为220 nm，对所测得各成分指标响应值较大，下一步会分别按2015版《中国药典》对各成分进行分别含量测定，与本实验所测得含量进行比较，来分析含量偏差。

[1] 孙艳涛.HPLC 双波长法同时测定消石利胆胶囊中芍药苷、橙皮苷、黄芩苷和大黄酚的含量[J].中国药师,2016,19(4):801-803.

[2] 刘阿静,齐广才,刘珍叶,等. RP-HPLC法测定防风通圣丸中芍药苷、栀子苷、黄芩苷和连翘苷的含量[J].西北药学杂志,2012,27(5):415-417.

[3] 杨庆胜,冯朝岭,司根令.HPLC 同时测定加味逍遥丸中栀子苷和芍药苷的含量[J].中国现代中药,2015,17(1):61-63.

[4] 厍士芳,黄芩属植物的药用价值研究[J].中医药信息,2012,29(3):139-142.

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[7] 徐莲英,候世祥.中药制药工艺技术解析[M].北京:人民卫生出版社,2003:31-32.

[8] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[S].2005版,北京:化学工业出版社，2015:191

[9] 滕宇,卢静华.RP-HPLC法同时测定地榆槐角丸中芍药苷、橙皮苷和黄芩苷[J].中成药，2013,35(9):1 629-1 932.

[10] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[S]. 2005版,北京:化学工业出版社，2015:250

SimultaneouslyDeterminingtheContentofHesperidinandBaicalininMacula-RemovingYangyinParticlesbyRP-HPLC

Yang Quanwei1，Xiao Liu2*

(1.WuhanNo.1Hospital,Wuhan430000，China; 2.WuhanHospitalofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430000,China)

ObjectiveTo establish the efficient method to determine the content of Hesperidin and Baicalin in macula-removing Yangyin Particles by RP-HPLC.MethodsChromatographic column SinoChrom ODS-BPC18(4.6 mm×250 mm,5 μm)was used;Velocity:1.0 mL/min;Column temperature:30℃;Detection wavelength:220 nm;Flow phase:acetonitrile-0.1% acid water gradient (0～12 min,5% A to 10% A;12～25 min,10% A to 25% A;25～35 min,25% A to 35% A).ResultsThe return equation of hesperidin was Y1=12 147.47 X1-4 728.96,r=0.999 8,indicating that hesperidin had good linear relations within 0.243～2.43 μg.The return equation for baicalin is Y2=27 986.68 X2-5 324.71,r=0.999 9,indicating baicalin had good linear relations within 0.357～3.57 μg.ConclusionThe method established in this experiment is simple,feasible and practical,which can be used to control the quality of Macula-Removing Yangyin Particles.

macula-removing yangyin particles;hesperidin;baicalin;HPLC

杨全伟，男，硕士，主管药师，研究方向：中药制剂。*

肖柳，女，硕士，医师，主要从事中西医结合肿瘤方面的研究。

R284

A

1008-8164(2017)03-0027-03

2017-05-27责任编辑：艾茜