烟粉虱及其优势寄生蜂内共生菌的种类及系统发育分析

薛延韬，张毅波，张 焱，张桂芬，刘 怀，万方浩*，葛金燕

(1.西南大学植物保护学院，昆虫及害虫控制工程重庆市重点实验室，重庆 400715；2.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；3.湖南农业大学植物保护学院，长沙 410128)

烟粉虱及其优势寄生蜂内共生菌的种类及系统发育分析

薛延韬1,2，张毅波2，张 焱1,2，张桂芬2，刘 怀1，万方浩2*，葛金燕3

(1.西南大学植物保护学院，昆虫及害虫控制工程重庆市重点实验室，重庆 400715；2.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；3.湖南农业大学植物保护学院，长沙 410128)

为了研究入侵我国的2个主要烟粉虱隐种BemisiatabaciMEAM1和MED及其3种优势寄生蜂(浅黄恩蚜小蜂Encarsiasophia、丽蚜小蜂E.formosa、海氏桨角蚜小蜂Eretmocerushayati)体内感染内共生菌的种类丰度，并进一步探讨其系统发育关系，本文利用分子生物学手段对昆虫体内细菌的16S rRNA基因序列进行扩增、测序和分析，并采用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likehood, ML)分别构建优势内共生菌的系统发育树。结果表明，烟粉虱2个隐种内共生菌的种类丰度大于其3种优势寄生蜂，3种优势寄生蜂中丽蚜小蜂内共生菌的种类丰度最高；同源性分析发现烟粉虱和寄生蜂所携带的Rickettsia基因同源性达到99%，属于Rickettsiabellii种，进一步的进化树分析也发现所研究物种的Rickettsia和Hamiltonella均可各自聚为同一进化分支。烟粉虱及其优势寄生蜂体内含有种类丰富的内共生菌，其中优势内共生菌Rickettsia和Hamiltonella各自亲缘关系很近，说明内共生菌在烟粉虱和寄生蜂间可能进行水平传播。

烟粉虱；寄生蜂；内共生菌；16S rRNA；系统发育

烟粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)属于半翅目Hemiptera，粉虱科Aleyrodidae，是一种典型的高度多食性的刺吸式害虫，同时也是一种世界性的入侵害虫，其可通过直接取食植物韧皮部汁液、传播110多种植物病毒以及分泌蜜露诱发霉污病等方式为害作物，每年可导致数十亿美元的经济损失(Brownetal., 1995; Oliveiraetal., 2001; Jonesetal., 2003; Wanetal., 2016)。烟粉虱是一个独特的、复杂的复合种，由至少36个形态上难以区分的隐种组成(Boykinetal., 2007; De Barroetal., 2010; Dinsdaleetal., 2010; Liuetal., 2012; Firdausetal., 2013)。其中，“中东-小亚细亚1”隐种(Middle East-Asia Minor 1，简称MEAM 1，以前称之为“B型”)和“地中海”隐种(Mediterranean，简称MED，以前称之为“Q型”)是世界范围内的2个主要入侵烟粉虱隐种(Tayetal., 2012)，在过去的30多年里，在全世界造成了巨大的农业损失(Daltonetal., 2006; Zhangetal., 2015)。

在我国，烟粉虱MEAM1和MED隐种是分布最广泛、为害最严重的2个入侵隐种(Panetal., 2011)。MEAM1隐种于20世纪90年代中后期传入，并且很快地取代了本地种，而MED隐种于2003年第一次在我国云南昆明发现(Chuetal., 2006)。之后，MED隐种逐渐取代MEAM1隐种成为我国田间的主要发生种(Chuetal., 2010; Tengetal., 2010; Panetal., 2011)。MEAM1隐种具有较强的入侵能力和竞争力，而MED隐种具有较强的抗药性(Horowitzetal., 2003; Pascualetal., 2004; Dennehyetal., 2010)。随着化学农药的大范围使用，烟粉虱的抗药性也逐渐增强。为了避免进入农药使用量增加和抗药性增强的恶性循坏，利用生防作用物开展烟粉虱生物防治成为了当前的研究热点。生防作用物中，寄生性天敌又是最重要的组成部分。烟粉虱的寄生性天敌主要分布于恩蚜小蜂属Encarsia和桨角蚜小蜂属Eretmocerus，其中应用较为广泛的优势寄生蜂有丽蚜小蜂Encarsiaformosa，浅黄恩蚜小蜂Encarsiasophia以及海氏桨角蚜小蜂Eretmocerushayati3种。

烟粉虱体内携带有种类丰富的内共生菌，目前已报道有8种/属(Shanetal., 2016)。不同烟粉虱隐种所携带的次生内共生菌(Secondary endosymbiont)种类不同，包括“CandidatusHamiltonella defense”(Zchori-Feinetal., 2002)，“CandidatusWolbachia sp.”(Nirgianakietal., 2003)，Arsenophonussp.(Zchori-Feinetal., 2002)，“CandidatusFritschea bemisiae” (Everettetal., 2005)，“CandidatusCardinium hertigii”(Weeksetal., 2003)，Rickettsiasp.(Gottliebetal., 2006)和“CandidatusHemipteriphilus asiaticus”(Bingetal., 2013)。但是，它们都携带有相同的且能够为其提供维持生命活动所必需的营养物质的初生内共生菌(Primary endosymbiont)“CandidatusPortiera aleyrodidarum”(Sloanetal., 2012)。近年来，越来越多的研究表明，烟粉虱体内内共生菌在其种群扩散和入侵方面发挥了重要作用。比如，有研究发现双重感染Rickettsia-Arsenophonus或Wolbachia-Arsenophonus的烟粉虱MED隐种比只感染Arsenophonus的烟粉虱MED隐种对啶虫脒、噻虫嗪、吡虫啉和螺甲螨酯的敏感性较高(Ghanimetal., 2009)，表明内共生菌可能与烟粉虱的抗药性相关。Brumin等(2011)发现在以色列的烟粉虱MEAM1隐种种群中，热激情况下分布于类菌体外部的Rickettsia会降低，而处于类菌体内部的Portiera和Hamiltonella几乎不受影响；而Shan等(2014)发现在中国的烟粉虱MEAM1隐种种群中，在高温处理下处于类菌体内部的Portiera和Hamiltonella均降低，而分散的Rickettsia几乎不受影响，这表明内共生菌可能与烟粉虱的耐热性相关。因此，以次生内共生菌作为对象来研究烟粉虱的生物学特性、入侵能力及对隐种间取代的影响成为了当前的热点(Chuetal., 2011; Himleretal., 2011)。

除了烟粉虱外，许多研究也围绕共生菌在烟粉虱的优势寄生蜂中的传播和功能展开。Chiel等(2009)研究表明Rickettsia在寄生蜂Eretmocerusemiratus和Eretmoceruseremicus体内没有进入卵母细胞，仅局部存在于卵泡细胞，所以Rickettsia无法在这两种寄生蜂体内进行垂直传播，在寄生蜂Encarsiapergandiella体内也只是短暂存在于消化道中，并在化蛹前排出体外；同时，水平传播实验的结果则表示寄生蜂通过与感染Rickettsia的烟粉虱接触后能够普遍获菌，但是一旦离开含菌粉虱，寄生蜂的感菌率又会急剧下降(Maetal., 2004)。烟粉虱与寄生性天敌之间大多都是专性寄生，对于烟粉虱及其寄生蜂共同携带的内共生菌种类和系统发育的研究，将有助于更加明确内共生菌在烟粉虱和寄生蜂之间的传播方式，以期为深入研究寄生蜂对烟粉虱的防控提供理论基础。

为了明确入侵我国的2个主要烟粉虱隐种BemisiatabaciMEAM1和MED及其3种优势寄生蜂(浅黄恩蚜小蜂En.Sophia、丽蚜小蜂En.formosa、海氏桨角蚜小蜂Er.hayati)体内感染内共生菌的种类和丰度，并探讨其系统发育关系，本文采用分子生物学手段，通过克隆扩增出昆虫体内细菌的16S rRNA基因序列，连接转化后，经基因测序明确内共生菌的种类和丰度，并利用生物信息学的相关方法进行基因同源性分析，进一步对优势内共生菌开展系统发育分析。研究结果能够明确烟粉虱和寄生蜂体内感染内共生菌的种类和丰度，以及内共生菌在“烟粉虱-寄生蜂”种群间可能的传播途径，为今后烟粉虱及其优势寄生蜂内共生菌的深入研究提供参考，也有助于研究人员进一步理解内共生菌在“粉虱-寄生性天敌”互作中的重要作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1供试昆虫

烟粉虱MEAM1和MED隐种种群采自河北省廊坊市中国农业科学院植物保护研究所廊坊中试基地，不同隐种通过线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因(mtDNA-COⅠ)进行检测鉴定后，分别用笼罩单独饲养，并定期通过RAPD-PCR进行检测；3种寄生蜂分别为海氏桨角蚜小蜂、浅黄恩蚜小蜂和丽蚜小蜂，其中海氏桨角蚜小蜂和浅黄恩蚜小蜂种群于2008年从美国德克萨斯农工大学引入，丽蚜小蜂种群采集地与烟粉虱相同，三者均以烟粉虱为寄主用笼罩单独饲养。上述种群自采集或引入后，长期饲养于中国农业科学院植物保护研究所生物入侵研究室的温室中，气候条件为温度26℃-28℃、相对湿度65%±5%、光周期14 L ∶10 D。

1.1.2供试植物

烟粉虱使用棉花Gossypium进行饲养，品种为“中棉6号”，由中国农业科学院植物保护研究所廊坊农药厂提供。棉花种子种植于含营养土(组成：草木灰/蛭石为1 ∶1)的塑料花盆(规格：上口径10 cm×10 cm，高约9 cm)中，每盆2-3粒种子，放置在120目纱网的大型养虫笼(规格：60 cm×40 cm×60 cm)于温室中，待株高大于20 cm且至少有2片真叶时即可使用。培养条件与供试昆虫相同，供试植物不接触任何农药。

1.2 实验方法

1.2.1烟粉虱DNA的提取

用组织基因组DNA提取试剂盒提取烟粉虱的DNA。所用试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)由天根生化有限公司生产。取20头烟粉虱于灭菌的1.5 mL离心管中，放入-20℃冰箱冷冻5-8 min，加液氮研磨后，按照试剂盒说明书进行操作，最后将得到的烟粉虱DNA提取液置于1.5 mL离心管中，短暂低速离心，-20℃保存备用。

1.2.2寄生蜂DNA的提取

用裂解液法提取3种优势寄生蜂的DNA。研磨方法与烟粉虱DNA提取相同，之后加入50 μL的裂解液(10 mM Tris-HCL，pH 8.4；50 mM KCl；0.45% Tween 20；0.45% NP40；0.2% Gelatin；60 μg/mL Proteinase K)；将带有匀浆液的离心管置于65℃金属浴30 min、96℃金属浴10 min；短暂低速离心，即得到寄生蜂DNA提取液，-20℃保存备用。

1.2.3细菌16S rRNA基因序列的PCR扩增

分别以所获得的烟粉虱和寄生蜂的总DNA为模板，利用细菌16s rRNA基因通用引物27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492R(5′-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)(Weisburgetal., 1991)进行PCR扩增。扩增反应体系(25 μL)包括：总DNA模板2.0 μL、10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 2.5 μL、双向引物各1.0 μL、Taq聚合酶0.2 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反应程序如下：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，共30个循环；72℃后延伸7 min，4℃保存。对于每种DNA样品，均设置3个重复的PCR反应；对于每次PCR反应，均设置含目的片段的烟粉虱或寄生蜂DNA和ddH2O分别作为阳性和阴性对照。扩增反应在ABI-9700 PCR基因扩增仪上进行。扩增完成后将3个重复的PCR产物合并一起，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，以GelDoc Universal Hood II型凝胶成像系统分析结果，扩增片段大小约为1500 bp。

1.2.4PCR产物的纯化、连接、转化及测序

使用DNA凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收PCR产物。所用试剂盒(AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒)由康宁生命科学有限公司提供。所有操作按照试剂盒说明书进行。纯化所得PCR产物连接到PEASY-T3载体中，将其转入Trans-T1感受态细胞；每个物种选取40个有效菌落进行验证，将其中正确的转化子送上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.3 数据分析

1.3.1内共生菌的种类分析

利用Bioedit 7.2.6软件(Hall, 1999)对测序所得的16S rRNA基因序列进行拼接并辅以人工矫正等处理后，在NCBI上进行BLAST同源性比对分析，以同源性在99%-100%为标准，对内共生菌的种类进行鉴定，并分别对各内共生菌的数量进行统计，同时记录比对时各序列同源性最高的序列信息；在Ribosomal Database Project(RDP)上对共生菌16S rRNA基因序列进行Classifier归类(Wangetal., 2007)。

1.3.2系统发育分析

基于1.3.1的分析结果，进一步对烟粉虱MEAM1和MED隐种及其3种优势寄生蜂感染的优势内共生菌进行系统发育分析。以Bioedit 7.2.6软件读取序列，对每条序列进行人工碱基读取和反复校对；采用DAMBE 6.4.79软件(Xia, 2017)对核苷酸替代饱和性进行分析；选取NCBI中已报道的不同宿主携带的上述优势内共生菌及隶属于同属不同群组的多条16S rRNA基因序列作为参考序列，并选取外群(Outgroup)，结合本研究测序获得的5个物种携带的优势内共生菌16S rRNA基因序列，利用Clustal W程序对序列进行多重序列比对，并辅以人工校对；应用Mega 7.0.26(Kumaretal., 2016)软件以双参数模型(Kimura 2-parameter, K2-P)，采用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likehood, ML)分别构建系统发育树，系统发育树分支的置信度采用自展法(Bootstrap analysis, BP)，重复检测1000次。

2 结果与分析

2.1 烟粉虱MEAM1和MED及其3种优势寄生蜂内共生菌的种类丰度分析

对测序所得的烟粉虱MEAM1和MED隐种及其3种优势寄生蜂内共生菌16S rRNA基因序列的同源性比对表明，这5个物种感染内共生菌的种类丰度有明显的差异(表1)。烟粉虱2个隐种均携带Portiera、Hamiltonella和Rickettsia，其内共生菌的种类丰度要大于3种优势寄生蜂；3种优势寄生蜂中以丽蚜小蜂内共生菌的种类丰度最高，其携带有Rickettsia、Hamiltonella和Wolbachia，另外2种寄生蜂则只含有Rickettsia；5个不同物种均携带Rickettsia，海氏桨角蚜小蜂Rickettsia的种类丰度显著高于其他物种。

内共生菌16S rRNA基因序列同源性比对中相似度最高的序列信息及Classifier归类结果见表2。烟粉虱MEAM1和MED隐种及其3种优势寄生蜂体感染有Portiera、Hamiltonella、Rickettsia和Wolbachia4种内共生菌，均隶属于变形菌门Proteobacteria，其中Rickettsia属于α-变形细菌纲(α-Proteobacteria)，Portiera、Hamiltonella和Wolbachia则属于γ-变形细菌纲(γ-Proteobacteria)，每一条序列与NCBI基因库中比对到的序列的相似度均达到99%。

2.2 烟粉虱MEAM1和MED及其3种优势寄生蜂的优势内共生菌的系统发育分析

由2.1结果可知，烟粉虱MEAM1和MED隐种及其3种优势寄生蜂共同感染的内共生菌有Rickettsia和Hamiltonella2种，为其优势内共生菌。烟粉虱MEAM1和MED隐种及其3种优势寄生蜂均携带有Rickettsia，携带Hamiltonella的有烟粉虱MEAM1和MED隐种及3种优势寄生蜂中的丽蚜小蜂。下面分别对2种优势内共生菌进行系统发育分析。

表1 烟粉虱MEAM1和MED隐种及其3种优势寄生蜂内共生菌的种类丰度

注：1.Others为比对结果不属于已报道的8种/属内共生菌；2.“-”表示不含有某种菌。Note: 1. The BLAST results not belonging to the eight species of endosymbiosis that have been reported count in the others; 2. The sign “-” indicates free for one bacterium.

表2 烟粉虱MEAM1和MED隐种及其3种优势寄生蜂内共生菌16S rRNA基因序列比对信息及分类地位

2.2.1优势内共生菌Rickettsia系统发育树的构建

在NCBI数据库中选取Rickettsia属的28个16S rRNA同源基因序列作为参考序列，以纤毛虫Diophrysappendiculata的Rickettisa16S rRNA基因作为外群，结合本研究测序获得的烟粉虱MEAM1和MED隐种及其3种优势寄生蜂的Rickettisa16S rRNA基因序列，采用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likehood, ML)构建系统发育树，结果分别如图1和图2所示。

采用NJ法对Rickettsia构建的系统发育树(图1)中，本研究中的烟粉虱MEAM1和MED隐种及其3种优势寄生蜂的Rickettsia与数据库中以色列的烟粉虱MEAM1隐种和日本的烟粉虱MED隐种的Rickettsia首先聚为一支，然后再与豌豆蚜Acyrthosiphonpisum、叶蝉Empoascapapayae、叶螨Tetranychusurticae、盲蝽象Macrolophuspygmaeus、烟盲蝽Nesidiocoristenuis及寄生蜂Pnigaliosoemius的Rickettsia和Rickettsiabellii聚为一大支，而与纤毛虫D.appendiculata的Rickettisa亲缘关系最远。采用ML法对Rickettsia构建的系统发育树(图2)表现出与NJ法类似的结果。

图1 邻接法构建的烟粉虱MEAM1和MED及其3种优势寄生蜂Rickettsia的系统发育树(包含参考序列和外群)Fig.1 Neighbor-Joining tree based on the analysis of Rickettsia from B. tabaci MEAM1, MED and its three dominant parasitoids (including the reference sequences and outgroup)

图2 最大似然法构建的烟粉虱MEAM1和MED及其3种优势寄生蜂Rickettsia的系统发育树(包含参考序列和外群)Fig.2 Maximum Likehood based on the analysis of Rickettsia from B. tabaci MEAM1, MED and its three dominant parasitoids (including the reference sequences and outgroup)

2.2.2优势内共生菌Hamiltonella系统发育树的构建

在NCBI数据库中选取Hamiltonella属的20个16S rRNA同源基因序列作为参考序列，以水生拉恩氏菌Rahnellaaquatilis和小肠结肠炎耶尔森氏菌Yersiniaenterocolitica的16S rRNA基因作为外群，结合本研究测序获得的烟粉虱MEAM1和MED隐种及丽蚜小蜂En.formosa的Hamiltonella16S rRNA基因序列，采用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likehood, ML)构建系统发育树，结果分别如图3和图4所示。

图3 邻接法构建的烟粉虱MEAM1和MED及其3种优势寄生蜂Hamiltonella的系统发育树(包含参考序列和外群)Fig.3 Neighbor-Joining tree based on the analysis of Hamiltonella from B. tabaci MEAM1, MED and its three dominant parasitoids (including the reference sequences and outgroup)

图4 最大似然法构建的烟粉虱MEAM1和MED及其3种优势寄生蜂Hamiltonella的系统发育树(包含参考序列和外群)Fig.4 Maximum Likehood based on the analysis of Hamiltonella from B. tabaci MEAM1, MED and its three dominant parasitoids (including the reference sequences and outgroup)

采用NJ法对Hamiltonella构建的系统发育树(图3)中，本研究中的烟粉虱MEAM1和MED隐种及丽蚜小蜂En.formosa的Hamiltonella与数据库中中国的烟粉虱MEAM1和MED隐种及以色列的烟粉虱MEAM1隐种的Hamiltonella聚为一小支，然后与美国的烟粉虱MEAM1隐种的Hamiltonella聚为一大支；而与其余物种的Hamiltonella均未在同一分支；与水生拉恩氏菌R.aquatilis和小肠结肠炎耶尔森氏菌Y.enterocolitica亲缘关系最远。采用ML法对Hamiltonella构建的系统发育树(图4)表现出与NJ法类似的结果。

3 结论与讨论

在本研究中，烟粉虱MEAM1和MED隐种感染的Hamiltonella含量均最高，这与以前的报道相一致。目前，Hamiltonella和Rickettsia已成为烟粉虱的优势次生内共生菌。但是，Chu等(2011)研究表明，除了Hamiltonella和Rickettsia外，这两种烟粉虱隐种还会感染有Wolbachia、Arsenophonus和Cardinium。由于内共生菌在烟粉虱体内是不固定的，因此，生物和非生物环境等因素都会对内共生菌产生影响，它们可以直接作用于内共生菌，或者间接影响宿主，从而导致昆虫胞内共生菌与宿主之间关系的不稳定性(Cassetal., 2015)。例如，共生菌Wolbachia在澳大利亚黑腹果蝇Drosophilamelanogaster种群中的感染率比较稳定(Hoffmannetal., 1994; Hoffmannetal., 1998)；共生菌Serratia可保护蚜虫抵抗热激(Russelletal., 2006)，并与蚜虫分布在干旱地区有关(Henryetal., 2013)；共生菌Cardinium在库蠓Culicoidesis中的感染率与地中海地区地面的温度有关(Moragetal., 2012)；在日本，感染共生菌Regiella能够影响豌豆蚜A.pisum宿主的专化性(Tsuchidaetal., 2004)；在美国，Rickettsia的感染频率在不同地区之间存在差异：在西南部的棉花种植区感染频率特别高，而在圣华金河谷和德克萨斯州的东南以及南部的部分地区处于中间感染水平(Cassetal., 2015)；同样，Shan等(2014)对我国田间采集到的烟粉虱MEAM1和MED隐种检测发现，MEAM1隐种携带有初生内共生菌Portiera及2种次生内共生菌Hamiltonella和Rickettsia，而MED隐种则携带Portiera和Hamiltonella。这些结果都表明，昆虫体内内共生菌的存在与变化受多种因素的影响。

准确鉴定烟粉虱及其寄生蜂携带的内共生菌种类并对其进行系统发育分析，对于研究内共生菌与宿主间的互作关系意义重大。本研究中，通过对昆虫内共生菌16S rRNA基因序列进行BLAST同源性比对和Classifier归类，得到了内共生菌鉴定和分类相同的结果；在以Rickettsia或Hamiltonella的16S rRNA基因序列为靶标对两者进行系统发育分析时，无论是邻接法还是最大似然法，烟粉虱MEAM1和MED隐种及其3种优势寄生蜂的Rickettsia或Hamiltonella均聚为一支，且就烟粉虱及其寄生蜂而言可形成独立的进化支，其聚类结果也符合BLAST同源性比对和Classifier归类结果。这说明内共生菌的16S rRNA基因可用于对其进行鉴定和分类分析。

无论是烟粉虱还是寄生蜂的内共生菌均属于变形菌门的α-变形细菌纲或γ-变形细菌纲。已有研究表明，Rickettsia可分为4个分支，即bellii group、transitional group、spotted fever group和typhus group，而本研究中烟粉虱和寄生蜂携带的Rickettsia16s rRNA基因序列均聚为一支，属于Rickettsiabellii group，与其他取食植物韧皮部汁液类的刺吸式昆虫如蚜虫和叶蝉的Rickettsia也有较近的亲缘关系(Bruminetal., 2012)。此外，除了MEAM1和MED隐种外，Rickettsia在烟粉虱Asia II 3(即“ZHJ1型”)、Asia II 7(即“Cv型”)、Indian Ocean(即“MS型”)和China 1(即“ZHJ3型”)等隐种上均有报道(Bingetal., 2013)。对于Hamiltonella而言，本研究中烟粉虱和寄生蜂的Hamiltonella16s rRNA基因序列同其他4个烟粉虱种群均聚为一支，说明烟粉虱感染的Hamiltonella具有较近的亲缘关系。这说明，刺吸式昆虫烟粉虱及其优势寄生蜂所携带的Rickettsia和Hamiltonella在“烟粉虱-寄生蜂”间可能存在水平传播，同时也进一步说明，内共生菌在不同宿主昆虫之间进行相互感染和传播的可能性很大。

在烟粉虱中，Rickettsia的分布呈现多样性(Gottliebetal., 2006)，而其他内共生菌都存在于宿主的菌胞中。有研究表明，Rickettsia一般随卵母细胞进行垂直传播，而进一步研究发现，在烟粉虱成虫的中肠中聚集有大量的Rickettsia，其可能是在卵母细胞和卵细胞发育后期进入肠组织(Bruminetal., 2012)。对于内共生菌在宿主体内的分布和传播，还有待进一步研究。

本研究中所用的烟粉虱种群都携带有Portiera、Hamiltonella和Rickettsia，其寄生蜂都携带有Rickettsia，部分携带有Hamiltonella或Wolbachia，而宿主体内内共生菌的存在受多种因素的影响，不同种群携带的内共生菌种类丰度存在一定差异，对于本研究讨论的Rickettsia和Hamiltonella以外的其他内共生菌的鉴定及系统发育情况，还有待于进一步对其他种群进行研究。此外，本研究选取细菌16s rRNA基因进行测序，其存在于所有细菌的基因组中，具有高度的保守性，但是相对于其他技术方法，如宏基因组测序而言，仍存在一定的局限性。例如，16s rRNA基因测序得到的序列很多鉴定不到种水平，而宏基因组测序能鉴定微生物到种水平甚至菌株水平。

寄生蜂对于烟粉虱具有较大的控害效果和防治潜力，对寄生蜂和烟粉虱共同感染的内共生菌的种类及系统发育研究，不仅有助于进一步明确内共生菌对于宿主的重要作用及其在“烟粉虱-寄生蜂”间可能存在水平传播途径，还可为深入研究内共生菌在“烟粉虱-寄生蜂”间的互作关系提供一定参考。

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DiversityandphylogeneticaffiliationofendosymbiontsfromBemisiatabaci(Hemiptera:Aleyrodidae)anditsdominantparasitoids

XUE Yan-Tao1,2, ZHANG YI-Bo2, ZHANG Yan1,2, ZHANG Gui-Fen2, LIU Huai1, WAN Fang-Hao2*, GE Jin-Yan3

(1. Chongqing Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering, College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. State Key Laboratory for the Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Plant Protection Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 3. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

To determine the diversity and phylogenetic affiliation of endosymbionts harboured by two mainly invasive cryptic speciesBemisiatabaciMEAM1 and MED and its three dominant parasitoids (Encarsiasophia,En.formosa,Eretmocerushayati), the 16S rRNA gene sequences of the endosymbionts was cloned, sequenced and analyzed using molecular biology methods. Phylogenetic trees based on the sequences of the dominant endosymbionts were constructed with Neighbor-Joining (NJ) and Maximum Likehood (ML). The results showed that the symbiotic diversity ofB.tabaciMEAM1 and MED was greater than those of the three dominant parasitoids. Among three dominant parasitoids, the diversity of endosymbionts inEn.formosawas the highest. In the homology analysis, theRickettsiain the five insect species had 99% similarity, and all belonged toRickettsiabelliigroup. The phylogenetic trees showed that theRickettsiain the five insect species were clustered together, and theHamiltonellashowed similar results. It suggested thatB.tabaciand its three dominant parasitoids contained a variety of endosymbionts, and the dominant endosymbiontsRickettsiain the five insect species have a close genetic relationship, which is conformed to theHamiltonella, indicating that the endosymbionts could occur horizontal transmission betweenB.tabaciand parasitoids.

Bemisiatabaci; parasitoids; endosymbionts; 16S rRNA; phylogenetic

国家重点研发专项(2016YFC1202100)；中国博士后基金面上基金(2015M570183)；泰山学者项目；国家国际科技合作专项资助(2015DFG32300)

薛延韬，男，1992年生，硕士研究生，研究方向为入侵生物学，E-mail：yantao_xue@163.com

*通讯作者Author for correspondence, E-mail: wanfanghao@caas.cn

Received: 2017-07-17; 接受日期Accepted: 2017-07-31

Q968;S476+.3

：A

1674-0858(2017)04-0741-11

薛延韬，张毅波，张焱,等.烟粉虱及其优势寄生蜂内共生菌的种类及系统发育分析[J].环境昆虫学报，2017,39(4):741-751.