色钉菇多糖抗运动病作用的研究

张涛 刘亚宁 乔兰侠 姚辉 王立安 王艳芹 管振龙

·论著·

色钉菇多糖抗运动病作用的研究

张涛 刘亚宁 乔兰侠 姚辉 王立安 王艳芹 管振龙

目的研究色钉菇多糖的抗运动病作用及其最佳剂量。方法以成年雄性SD大鼠为对象，随机分为空白对照组、实验对照组和3个不同剂量的色钉菇多糖的实验组(100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg)，每组12只；实验对照组和实验组在胃内给予生理盐水和相应剂量的色钉菇多糖0.5 h后，用偏离垂直轴旋转1.5 h复制运动病模型，通过行为学和生物化学方法检测运动病程度和血清中5-羟色胺(5-HT)和胃动素的水平。结果实验对照组糖精水摄入量与转前1 d相比，转后第1天和第2天相对转前1 d显著减少(P<0.01)，转后第3天摄入量虽然有所增加，但与转前1 d比较差异仍有统计学意义(P<0.05)；100 mg/kg多糖组糖精水摄入量只在旋转后第1天相对转前减少(P<0.05)，第2天就恢复到旋转前水平(P>0.05)。200 mg/kg多糖组旋转前后差异无统计学意义(P>0.05)，与空白对照组相似；400 mg/kg多糖组旋转后第1天，糖精水摄入量较转前1 d显著减少(P<0.01)，旋转后第2天开始提高(P<0.05)，第3天恢复到旋转前水平。实验对照组大鼠自主活动明显减弱，探究活动少，主要表现为静卧，与空白对照组相比潜伏期显著增长(P<0.05)。胃内给予色钉菇多糖溶液后旋转，100 mg/kg、200 mg/kg多糖组大鼠的自主活动能力基本正常，活动频繁，意识较清楚，探究行为多，潜伏期与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。400 mg/kg多糖组大鼠旋转后在中央格内停留时间较长，与空白对照组潜伏期比较差异有统计学意义(P<0.01)。实验对照组修饰时间与空白对照组大鼠相比显著增加(P<0.05)；胃内给予色钉菇多糖溶液后旋转，100、200 mg/kg多糖组大鼠在旷场中自主活动相对频繁，修饰时间与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，与实验对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。但400 mg/kg多糖组大鼠置于中央格后，意识不清醒，活动能力较弱，在恢复约5 min后修饰行为出现并且修饰时间明显增加，与空白对照组差异有统计学意义(P<0.05)。偏离垂直轴旋转刺激后，实验对照组血清中 5-HT 水平显著升高(P<0.05)；色钉菇多糖组与实验对照组相比，5-HT含量降低，且剂量为200 mg/kg 时降低效果最显著(P<0.05)。而血清中胃动素水平在实验对照组显著降低(P<0.05)；色钉菇多糖组则显著升高(P<0.05)，且剂量为200 mg/kg 和400 mg/kg 时升高的最显著(P<0.01)。结论色钉菇多糖有显著的抗运动病作用，以200 mg/kg剂量的效果最佳。

运动病；色钉菇多糖；旷场实验；5-羟色胺；大鼠

【Abstrat】ObjectiveTo investigate the effects of chroogomphisrutilus polysaccharides on motion sickness and optimal dose in rats.MethodsThirty-six adult male SD rats were randomly divided into blank control group,experimental control group and three experimental groups (chroogomphisrutilus polysaccharides 100mg/kg, 200mg/kg,400mg/kg),with 12 rats in ech group. The rats in experimental control group and three experimental groups were given physiological saline and the corresponding dose of chroogomphisrutilus polysaccharides by gavage,half an hour later, motion sickness models were established by off-vertical axis rotation for 1.5 hours,then the behavioral symptoms of motion sickness and the serum level of the 5-HT,motilin were observed by behavioral approach and biochemical methods,respectively.ResultsAfter medication the autonomic activities and exploratory behavior in experimental control group were obviously decreased, however, the incubation period was significantly increased, as compared with those in blank control group (P<0.05). After medication with chroogomphisrutilus polysaccharides, the autonomic activity abilities in 100mg/kg polysaccharose group and 200mg/kg polysaccharose group were basically normal,and there was no significant difference in incubation period between the two medication groups and blank control group (P>0.05). However the residence time in certral lattice in 400mg/kg polysaccharose group was significantly longer than that in blank control group (P<0.05).The modification time in experimental control group was significantly increased，as compared with that in blank control group ( P < 0． 05) ． After medication the autonomic activities in open field in 100mg /kg polysaccharose group and 200mg /kg polysaccharose group were relatively frequent，but there was no significant difference in modification time between the two medication groups and blank control group ( P > 0 ． 05 ) ，however，there wassignificant difference in modification time between the two medication groups and experimental control group ( P < 0． 05) ． After off-vertical axis rotatory stimulation，the serum levels of 5-HT in experimental control group were significantly increased ( P < 0． 05) ，moreover，the serum levels of 5-HT in polysaccharide groups were significantly decreased，as compared with those in experimental control group，furthermore，the decrease effects in 200mg /kg polysaccharose group were the most obvious ( P < 0． 05) ． The serum levels of motilin in experimental control group were significantly decreased ( P < 0． 05) ，however， which in polysaccharose groups were obviously increased ( P < 0． 05 ) ，moreover the increase degree in 200mg /kg polysaccharose group and 400mg /kg polysaccharose group was most significant ( P < 0． 01) ． As mentioned above，the behavior symptoms of rats with motion sickness were obviously improved after medication with chroogomphisrutilus polysaccharides，and the serum levels of 5-HT were significantly decreased，however the serum levels of motilin were significantly increased by pretreatment with the chroogomphisrutilus polysaccharides． Among the 3 experimental groups，the 200 mg /kg polysaccharide group had the optimal effects of anti - motion sickness． Conclusion The chroogomphisrutilus polysaccharides has obvious anti - motion sickness effects，and the optimal dose is 200mg /kg．

运动病(motion sickness，MS)是晕车、晕船、晕机以及航天运动病的统称，主要是异常运动或视觉刺激导致的植物神经系统功能紊乱，产生眩晕、嗜睡、恶心、呕吐等一系列不适症状[1]。随着科技的进步，人类乘坐快速交通工具的时间也越来越长，MS发生的几率也随之增加。对于一般人员来说，该症状不会导致严重的后果，但对于航天员、飞行员或战士来说则可能是致命的，因为注意力的不集中会导致对仪器操作的失误或战斗力的下降，所以研制有效且无副作用的预防和治疗MS的药物是当前的研究热点之一。当今，关于MS发生的机制，现已提出多种假说，主要有感觉冲突理论、中枢神经递质失平衡理论、大脑皮质等高级中枢失调假说、内分泌功能异常假说等。尽管上述假说尚不能全面阐述MS发生的机制，但抗MS药物研制多是从这些假说出发，检测相应指标的改变情况，如检测血液内的激素[2-4]——精氨酸加压素、皮质醇、胃动素等和神经递质水平[5-7][5-羟色胺(5-HT)、乙酰胆碱、P物质等]、观察动物行为变化[8](如条件性味觉厌恶、异食癖)等，以确定药效。广泛应用的防治MS药物主要是抗胆碱药、抗组胺药、拟交感药、钙拮抗剂和胃动剂[9]。这些药物均能减轻MS症状，但都有不同程度的副作用，如嗜睡、注意力下降、视觉模糊等，不能满足航天员、飞行员和战士抗MS的需要。近年来发现以中草药为基础研制的抗MS药具有很好的疗效，且副作用小，但存在着成分复杂、作用机制不明等缺点，尚不能广泛应用。因此，研制高效、无毒副作用、成分清楚、作用机制明确的新型抗MS药物成为本领域最为关注的课题。色钉菇(Chroogomphis Rutilus)，又称血红铆钉菇，属担子菌亚门层菌纲伞菌目铆钉菇科，俗称松树伞、松蘑、红蘑、肉蘑等。中医认为，该真菌性平、味甘，具有强身健体，益肠胃，止痛，理气化痰之功效[10]。研究表明，色钉菇子实体中含有大量的生物活性成分，如三萜类、酚类、黄酮类、苯并吡喃和多糖等，具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫等多种作用[11]。有资料显示，部分真菌提取物有抗MS效果，如天麻多糖和蜜环菌多糖混合物能有效防治机械旋转导致的抗晕作用[12]。日本的空间站应用可行性研究文献中报道，以松蘑为主的蘑菇清汤有明显的抗MS效果[13]，故推测溶于清汤中的多糖可能是抗MS的有效成分。因此，本文拟以偏离垂直轴旋转复制运动病模型，通过行为学和生化等检测方法探讨色钉菇多糖对大鼠MS的防治效果，以期为研制新型抗运动病药物提供新的选项。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠60只，雄性，体重200～250 g，购于河北医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003，合格证号：1304014。

1.2 色钉菇多糖与试剂 色钉菇多糖(自制)；食用糖精(天津市北方食品有限公司)；氯化钠(天津市永大化学试剂有限公司)；戊巴比妥钠；大鼠胃动素 ELISA 试剂盒(上海沪峰生物科技有限公司)；大鼠 5-HT ELISA试剂盒(上海沪峰生物科技有限公司)。

1.3 仪器 偏离垂直轴旋转仪(off-vertical axis rotation，OVAR；香港大学医学院陈应城教授惠赠)；超纯水系统(MILLIPOREQB，美国)；冷冻离心机(Centrifuge 5810 R,eppendorf)；磁力加热搅拌器(常州国华电器有限公司)；三星ST 600摄像机；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；旷场实验箱100 cm×100 cm×40 cm(长×宽×高)，箱底均分为 25 个方格(20 cm×20 cm)。

1.4 实验方法

1.4.1 色钉菇多糖的提取:以蒸馏水洗涤色钉菇子实体3次，洗净后放入烘箱，45℃烘干备用。将洗净烘干的子实体粉碎、称重。以子实体粉末∶蒸馏水=1 g∶10 ml 的比例混合，于80℃水浴锅内进行水浴加热，并用电动搅拌棒不间断搅拌。浸提8 h后，离心(8 000 r/min，10 min)取上清浸提液，回收底部的子实体沉淀，重复加水、水浴、离心、取上清浸提液2次，将3次所得的上清液合并，于旋转蒸发仪中蒸发浓缩。向浓缩后的浸提液中加入3倍体积的95%乙醇，4℃沉淀过夜，可观察到色钉菇多糖絮状物析出。取出絮状物，用无水乙醇洗涤数次，真空冷冻干燥后即得色钉菇多糖。

1.4.2 ①动物分组及处理:购入大鼠后，随机分为空白对照组、实验对照组和3个实验组(100 mg/kg色钉菇多糖组、200 mg/kg色钉菇多糖组和400 mg/kg色钉菇多糖组)，每组12只，其中6只用于行为学检测，另6只用于血清内的激素和神经递质的检测。进行行为检测的动物，购入后适应性饲养3 d，在给予OVAR刺激前1 d禁水24 h并适应旷场环境15 min。第2天早晨称量大鼠体重，在8∶00让大鼠自由饮用浓度为 0.15%的糖精水45 min，记录每只大鼠的饮用量。然后，空白对照组和实验对照组大鼠按10 ml/kg剂量，胃内给予0.9%氯化钠溶液；3个实验组大鼠分别按照100 mg/kg、200 mg/kg和400 mg/kg剂量，胃内给予色钉菇多糖溶液。灌胃后30 min，实验对照组和实验组动物进行OVAR旋转刺激诱发运动病，具体参数为偏离垂直轴10°、旋转频率1.5 Hz、持续旋转时间1.5 h。空白对照组不给予旋转刺激，但置于旋转刺激仪旁接受噪音刺激。旋转结束后，各组大鼠均即刻进行旷场实验检测，并在第2天8∶00自由饮用0.15% 糖精水45 min，记录5组糖精水的饮用量，连续记录3 d。②检测血清内的激素和神经递质的动物除不进行糖精水厌恶和旷场实验外，其他处理同上。

1.4.3 旷场实验:将大鼠放入旷场中央格内，用录像机记录大鼠10 min在旷场内的活动情况。每次实验结束后用消毒酒精擦拭箱底和四壁，以去除上只大鼠尿液、粪便的影响。统计大鼠潜伏期(旷场底面中央的9个格为中央区域，在中央区域的停留时间)、修饰行为(舔毛、舔足、两前肢理毛、抚嘴等)。

1.5 检测血浆中神经递质和激素含量 旋转刺激结束后的 30 min 内采血。采血时，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg/kg)，麻醉后打开腹腔，剪开心包，用 5 ml 注射器心尖部采血 4～5 ml。将所采的血液在室温静置60 min后，置于冷冻离心机中，4℃、 3 000 r/min离心 15 min，取上清液即血清分装于 EP 管中待测。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 动物行为表现 空白对照组大鼠未经灌胃和旋转，虽然在实验对照组旋转时被放置于仪器旁，但活动均正常。表现为意识清楚，活动灵敏，四肢行走正常，探索行为较多，进食、饮水正常未受影响；实验对照组大鼠在OVAR旋转刺激结束后，表现为运动少、活动范围小、走路打晃、行为迟缓、目光呆滞、呼吸急促、颤抖、炸毛和大小便失禁等明显的运动病症状；实验组中，100 mg/kg组合400 mg/kg组大鼠表现为活动少、较多的修饰行为、少量的尿失禁、轻微的颤抖和竖毛，而200 mg/kg组大鼠基本与空白对照组的活动相似，走路迅捷、步态稳定、无大小便失禁、竖毛、颤抖等行为，仅有少量的修饰行为。

2.2 糖精水条件性味觉厌恶检测结果 空白对照组大鼠在前后4 d的精水摄入量差异无统计学意义(P>0.05)；实验对照组糖精水摄入量与转前1 d相比，转后第1天和第2天相对转前1 d显著减少(P<0.01)，转后第3天摄入量虽然有所增加，但与转前1 d比较差异仍有统计学意义(P<0.05)；100 mg/kg多糖组糖精水摄入量只在旋转后第1天相对转前减少(P<0.05)，第2天就恢复到旋转前水平(P>0.05)。200 mg/kg多糖组旋转前后差异无统计学意义(P>0.05)，与空白对照组相似；400 mg/kg多糖组旋转后第1天，糖精水摄入量较转前1 d显著减少(P<0.01)，旋转后第2天开始提高(P<0.05)，第3天恢复到旋转前水平。见表1。

组别转前1d转后第1天转后第2天转后第3天空白对照组 10．92±2．999．60±2．6011．58±1．8412．00±1．74实验对照组 12．58±1．916．02±2．44#8．20±2．35#9．75±1．75∗100mg/kg多糖组15．18±2．4810．98±3．00∗12．77±4．0215．15±3．58200mg/kg多糖组14．23±4．0413．75±1．0714．52±2．4316．12±2．85400mg/kg多糖组13．82±2．419．15±2．54#13．28±2．90△14．73±2．58☆

注：与转前1 d比较,*P<0.05,#P<0.01;与转后第1天比较,△P<0.05;与转后第1天比较,☆P<0.01

2.3 旷场实验结果

2.3.1 潜伏期统计结果：实验对照组大鼠自主活动明显减弱，探究活动少，主要表现为静卧，与空白对照组相比潜伏期显著增长(P<0.05)。胃内给予色钉菇多糖溶液后旋转，100 mg/kg、200 mg/kg多糖组大鼠的自主活动能力基本正常，活动频繁，意识较清楚，探究行为多，潜伏期与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。400 mg/kg多糖组大鼠旋转后在中央格内停留时间较长，与空白对照组潜伏期比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

2.3.2 修饰时间统计结果：空白对照组大鼠，活动正常，舔毛、抚嘴等修饰动作出现少，时间短；实验对照组，运动病症状明显，自主探究活动极少，恢复约5 min后出现舔毛、舔足、两前肢抚嘴等修饰行为，修饰时间与空白对照组大鼠相比显著增加(P<0.05)；胃内给予色钉菇多糖溶液后旋转，100 mg/kg、200 mg/kg多糖组大鼠在旷场中自主活动相对频繁，修饰时间与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，与实验对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。但400 mg/kg多糖组大鼠置于中央格后，意识不清醒，活动能力较弱，在恢复约5 min后修饰行为出现并且修饰时间明显增加，与空白对照组差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3.3 修饰次数：实验对照组较空白对照组修饰次数有增加的趋势，胃内给与色钉菇多糖后旋转，100 mg/kg、200 mg/kg多糖组大鼠修饰次数有减少的趋势。但400 mg/kg多糖组大鼠修饰次数与实验对照组相近。5组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组别 潜伏期(s)修饰时间(s)修饰次数(次)空白对照组 5．50±5．4316．67±5．822．33±1．21实验对照组 21．50±15．78∗99．17±50．05∗4．67±3．50100mg/kg多糖组6．17±7．0518．33±24．16△1．17±1．60200mg/kg多糖组4．33±4．13△☆18．83±23．99△1．33±1．21400mg/kg多糖组23．33±11．60#63．50±48．29∗4．00±3．90

注：与空白对照组比较,*P<0.05,#P<0.01;与实验对照组比较,△P<0.05;与400 mg/kg多糖组比较,☆P<0.01

2.4 血清中神经递质和激素含量的实验结果 偏离垂直轴旋转刺激后，实验对照组血清中 5-HT 水平显著升高(P<0.05)；色钉菇多糖组与实验对照组相比，5-HT含量降低，且剂量为200 mg/kg 时降低效果最显著(P<0.05)。而血清中胃动素水平在实验对照组显著降低(P<0.05)；色钉菇多糖组则显著升高(P<0.05)，且剂量为200 mg/kg 和400 mg/kg 时升高的最显著(P<0.01)。这提示色钉菇多糖有降低运动病大鼠血清5-HT和升高胃动素水平的作用。见表3。

组别5⁃HT胃动素空白对照组 117．81±29．95210．25±51．08实验对照组 170．40±44．03∗139．91±34．99∗100mg/kg多糖组134．95±23．26204．46±55．89#200mg/kg多糖组121．01±28．86#216．90±38．65△400mg/kg多糖组141．98±26．02220．58±27．32△

注：与空白对照组比较,*P<0.05；与实验对照组比较,#P<0.05,△P<0.01

3 讨论

在以大、小鼠为对象的运动病机制和防治药物的研究中，复制运动病模型的方法有多种，其中本研究所用的偏离垂直轴旋转是以刺激耳石器来复制运动病模型的一种方法，是有效的常用手段之一。复制成功的运动病大鼠，在行为上主要表现为活动减少、修饰行为增多、炸毛、颤抖、大小便失禁等，这些行为表现成为检测运动病程度的重要指标[14]。条件性味觉厌恶是近年来用以检测运动病程度的另一个较为客观的行为指标[15]。其原理是，如果在运动病复制前给予糖精水，动物会将内脏或身体的不适与摄取糖精水的行为联系起来而建立对糖精水的条件性味觉厌恶反射，当再次给予糖精水时，动物对糖精水的摄取量会显著减少；再次饮用糖精水的量及其恢复正常饮用量所需时间均可作为运动病程度的指标。研究结果显示，复制运动病前半小时胃内给予色钉菇多糖，能显著增加动物的活动，无炸毛、颤抖、大小便失禁等运动病症状，特别是200 mg/kg剂量组动物，其行为与空白对照差异无统计学意义(P>0.05)；在复制运动病前后4 d的糖精水饮用量上，200 mg/kg剂量组动物与空白对照组相似，4 d之间差异无统计学意义(P>0.05)。旷场实验的实验数据统计结果也表明，给予色钉菇多糖后(100 mg/kg和200 mg/kg)大鼠在潜伏期、修饰时间和修饰次数上均与空白差异无统计学意义(P>0.05)。这些行为学检测结果提示，色钉菇多糖有显著地减轻运动病症状的作用，特别是200 mg/kg剂量的效果最佳。

恶心、呕吐、胃肠功能紊乱是运动病主要表现，而胃肠功能紊乱与调节其运动的胃肠激素的分泌密切相关，其中5-HT分泌的增加和胃动素分的降低是显著的特征[16]。有证据表明，运动病发生时血液中显著增加的5-HT是胃肠道分泌的，因脑干中缝核分泌的5-HT不能通过血脑屏障扩散至血液[17]。但胃肠道分泌的5-HT激活肠壁内的迷走神经传入末梢，将信号传至孤束核而引起相应的反射[18]。大量的研究表明，5-HT及其受体与运动病的发生密切相关，且5-HT3受体拮抗剂已作为有希望的抗运动病药物而备受关注[5,19,20]。血清中胃动素水平也常作为抗运动病药物的一个指标[4]。本实验所得结果显示，运动病大鼠血清中5-HT显著升高、胃动素水平显著降低，这与已有资料相同；在预先给予色钉菇多糖后，则血清中5-HT显著降低、胃动素显著升高，特别是200 mg/kg组，其与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。这提示色钉菇多糖的抗运动病作用可能与其降低胃肠分泌5-HT和升高胃动素的分泌有关。

本研究通过对行为学与血液神经递质和激素水平变化的研究，表明色钉菇多糖的确表现出显著的抗运动病效果，有开发成防治运动病药物的前景。本研究结果为防治运动病药物的筛选提供了新的选项和思路。

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Effectsofchroogomphisrutiluspolysaccharidesonmotionsicknessinrats

ZHANGTao*,LIUYaning,QIAOLanxia,etal.

*CollegeofLifeScience,HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang050024,China

motion sickness;chroogomphisrutilus polysaccharides;open field test;5-HT;rats

项目来源：河北省应用基础研究计划重点基础研究项目(编号：16237301D)；河北师范大学研究生创新资助项目(编号：xj2016033)

050024 石家庄市，河北师范大学生命科学学院(张涛、姚辉、王立安、王艳芹、管振龙)；河北经贸大学经济管理学院(刘亚宁)；石药集团中央药物研究二院(乔兰侠)

管振龙，050024 石家庄市，河北师范大学生命科学学院；

E-mail:zlguan60@hebtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.19.010

R 852.33

A

1002-7386(2017)19-2922-05

2017-02-08)