Rb、β及γ-catenin蛋白在进展期胃癌及转移淋巴结癌细胞中的表达及临床意义

张宇龙 范晓燕 何东伟 智英辉 周晔 刘淑贞 蔡建辉

·论著·

Rb、β及γ-catenin蛋白在进展期胃癌及转移淋巴结癌细胞中的表达及临床意义

张宇龙 范晓燕 何东伟 智英辉 周晔 刘淑贞 蔡建辉

目的探讨Rb、β与γ-catenin在进展期胃癌及转移淋巴结癌细胞再表达情况及其与临床病理诸因素的关系。方法应用免疫组织化学染色方法检测Rb在肿瘤原发灶及β与γ-catenin在86例进展期胃癌原发灶及其转移淋巴结癌细胞的表达情况。结果胃癌原发灶癌细胞中65.12%出现Rb阳性，38.37%转移淋巴结癌细胞出现β与γ-catenin再表达阳性，Rb与肿瘤分化程度密切相关(P<0.05)，β与γ-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达阳性与肿瘤分化程度密切相关(P<0.05)，γ-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达与肿瘤病理类型密切相关(P<0.05)，β-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达与肿瘤病理类型无关(P>0.05)，Rb表达与β- catenin在转移淋巴结癌细胞中再表达情况相关,与肿瘤病理类型、大小、浸润程度等因素无关(P>0.05)。γ与β-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达相关(P<0.05)，Rb在肿瘤原发灶癌细胞表达和β与γ-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达无关(P>0.05)。β与γ-catenin再表达阳性者3年生存率与再表达阴性者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论Rb表达与进展期胃癌发展过程密切相关，与β-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达有关,β与γ-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达是进展期胃癌发生过程中的重要事件，二者协同发挥作用，并对癌细胞在转移灶中聚集生长起重要作用，联合评价其功能具有重要临床意义。

Rb；β与γ-catenin；进展期胃癌；转移淋巴结；免疫组织化学；生存期

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，大量实验研究表明，胃癌发生与多个癌基因激活及抑癌基因缺失或突变有关[1]。视网膜母细胞基因(Rb基因)通过调节细胞周期变化，进而在细胞生长和分化中发挥重要作用。在视网膜母细胞瘤、胃癌、食管癌等肿瘤中发现Rb基因的突变或缺失，表明其与肿瘤的发生、发展关系密切，是一种重要肿瘤抑制基因[2]。连环素(caternis)是一类细胞质蛋白，包括α-、β-、γ-catenin等多种形式。它们与E钙粘蛋白(E-cadherin)结合起来完成细胞黏附功能。研究表明，γ-catenin可以介导E-cadherin与β-catenin结合形成复合体，附着于细胞骨架上起到维持细胞形态和分化的功能。其异常表达均与胃癌、食管癌、肺癌等的发生、分化、侵袭转移及预后密切相关。本实验应用SP免疫组化法检测Rb、β与γ-catenin 在进展期胃癌及其转移淋巴结癌细胞表达状况，探讨其与进展期胃癌各临床病理因素、相互间及与患者预后之间关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2009年6月至2012年6月于石家庄市第一医院外科手术切除并经病理证实的进展期胃癌标本86例，其中男70例，年龄37～75 岁；女16例，年龄42～72岁，平均年龄59.2±13.1岁。其中获随访71例。肿瘤组织病理类型包括：管状腺癌57例，粘液腺癌21例，印戒细胞癌4例，腺磷癌2例，未分化癌1例，磷癌1例。其中高分化14例，中分化21例，低分化51例，侵及浆膜层78例，未侵及浆膜8例。入选病例皆查实术前未进行化疗或放疗，无长期服用非甾体类抗炎物药及皮质激素药物史。

1.2 试剂 兔抗人多克隆β-catenin抗体购自NeoMarkers 公司，鼠抗人单克隆γ-catenin 及兔抗人多克隆Rb抗体购自Santa Cruz 公司，SP法试剂盒购自北京中杉公司。

1.3 方法 10%甲醛固定标本，石蜡包埋，4 μm切片。用免疫组化SP法，试剂盒使用依说明书。主要操作步骤如下，切片常规脱蜡，梯度酒精脱水(三次二甲苯，三次乙醇)。3%过氧化氢室温孵育10 min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗3次。将切片浸入0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH值6.0)中，微波加热至沸腾后断电，间隔5 min后重复2次，进行抗原修复，冷却后以PBS洗涤2次。滴加5%羊血清工作液进行封闭，室温处理20 min后弃去。滴加按一定比例稀释的一抗4℃过夜, PBS洗涤3次。滴加生物素标记二抗，室温孵育30 min，PBS冲洗3次。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，室温孵育30 min，PBS冲洗3次。以DAB反应显色，自来水充分冲洗后，以苏木素复染。最后常规脱水，透明，干燥，封片，显微镜下观察并拍照。PBS代替一抗为阴性对照，以切片上相对正常之粘膜组织为阳性对照。

1.4 结果判定

1.4.1 β与γ-catenin只有明显细胞膜染色被判定为正常染色；如染色不连续，或明显减弱、缺失，或者出现细胞浆染色，则被评定为不正常染色。每张切片按所有癌细胞之中的正常染色的细胞的百分比评定为三级：1级0～50%；2级51%～80%；3级81%～100%[3]。

1.4.2 原发灶如被评定为3级，则此病例则被认为是β与γ-catenin正常表达，而1级与2级染色则被认为是β与γ-catenin不正常表达；对于其转移淋巴结，如染色评定为3级而原发灶为1级或2级，或转移淋巴结染色评定为2级而其原发灶染色为1级，则此病例则被评定为β与γ-catenin再表达阳性；否则评定为再表达阴性。

1.4.3 Rb显色阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分；基本不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，将两类积分相乘0～1分为阴性,≥2分为阳性。

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，对数据使用χ2检验以及需要校正的χ2检验，分析进展期胃癌转移淋巴结癌细胞β与γ-catenin再表达的差异，应用Sperman秩相关法分析各指标表达相关性，绘制Kaplan-Meier曲线比较患者术后生存情况，以Wilcoxon’s log-rank test 对生存曲线行组间差别检验，用Cox’s proportional-hazard对影响生存率因素进行多变量分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β与γ-catenin在肿瘤原发灶的表达 在86例进展期胃癌病例中，β与γ-catenin在肿瘤原发灶癌细胞出现明显的细胞膜染色减弱或缺失，部分出现胞浆染色。异常表达率为96.51%(83/86)和94.19%(81/86)，仅1例肿瘤原发灶癌细胞两种连接蛋白表达正常。见图1。

2.2 Rb在肿瘤原发灶的表达 在86例进展期胃癌病例中，Rb阳性表达56例(65.12%)，与进展期胃癌肿瘤细胞分化程度密切相关(P<0.05)；与肿瘤细胞病理分型(未分化癌、印戒细胞癌、鳞癌与腺鳞癌因样本过小，未予统计)、肿瘤大小和浸润深度无关(P>0.05)。见图1,表1。

2.3 β与γ-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达情况及与临床病理各因素关系 β与γ-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达率为25.58%及24.42%。全部86例中，出现一种或两种连接蛋白阳性表达33例，出现一种连接蛋白阳性表达24例，出现两种连接蛋白阳性表达9例。γ-catenin在高中分化肿瘤转移淋巴结癌细胞再表达率为45.71%，高于低分化肿瘤转移淋巴结癌细胞再表达21.57%(P<0.05)；β-catenin在高中分化肿瘤转移淋巴结癌细胞再表达率为37.14%，高于低分化肿瘤转移淋巴结癌细胞再表达17.65%(P<0.05)。γ-catenin再表达与肿瘤病理分型(未分化癌、印戒细胞癌、鳞癌与腺鳞癌因样本过小，未予统计)密切相关(P<0.05)；β-catenin再表达与肿瘤病理分型无关(P>0.05)，γ-与β-catenin与肿瘤大小和浸润深度无关(P>0.05)。见表1。

图1 β,γ-catenin与Rb在肿瘤原发灶的表达(SP×200)

2.4 β与γ-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达及其与Rb表达相关性 22例β-catenin转移淋巴结癌细胞再表达阳性者9例γ-catenin再表达阳性，64例β-catenin转移淋巴结癌细胞再表达阴性者52例γ-catenin再表达阴性，β-catenin与γ-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达密切相关(P<0.05)。21例γ-catenin转移淋巴结癌细胞再表达阳性者14例Rb阳性表达，65例γ-catenin转移淋巴结癌细胞再表达阴性者23例Rb阴性表达，γ-catenin转移淋巴结癌细胞再表达与Rb表达无关(P>0.05)。22例β-catenin转移淋巴结癌细胞再表达阳性者11例Rb阳性表达，64例β-catenin转移淋巴结癌细胞再表达阴性者18例Rb阴性表达，β-catenin转移淋巴结癌细胞再表达与Rb表达相关(P<0.05 )。见表2～4。

表1 Rb在肿瘤原发灶表达和β与γ-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达与临床病理各因素关系 例

表2 β及γ-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达相关性

2.5 Rb表达和β与γ-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达与患者预后关系 全部86例患者中71例获随访，自手术日起至随访结束，生存时间7～68个月，平均生存时间36.2个月。获随访71例患者3年生存率30.9%，其中β-catenin再表达阳性者生存均数95%可信区间(19，30)，其中位生存时间23个月，再表达阴性者生存均数95%可信区间(34，47)，中位生存时间31个月，再表达阳性与阴性比较差异有统计学意义(P<0.05)；γ-catenin再表达阳性者生存均数95%可信区间(24，39)，中位生存时间23个月，再表达阴性者生存均数95%可信区间(31，44)，中位生存时间28个月，再表达阳性与阴性比较差异无统计学意义(P>0.05)；Rb蛋白表达阳性者生存均数95%可信区间(29，41)，中位生存时间25个月，表达阴性者生存均数95%可信区间(28， 44)，中位生存时间30个月，表达阳性与阴性比较差异无统计学意义(P>0.05)。生存曲线行组间差别检验，发现彼此间差异无统计学意义。多变量分析发现，其中β-catenin在胃癌转移淋巴结癌细胞再表达，可作为独立判断预后之因素(P<0.05 )。见表5、6,图2～4。

表3 β-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达与Rb表达关系

表4 γ-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达与Rb表达关系

表5 Rb、β与γ-catenin组间两两比较

表6 Rb、β与γ-catenin多变量分析

图2 β-catenin生存曲线

3 讨论

E-cadherin-连接素复合体在多种恶性肿瘤中异常表达[4,5]。E-cadherin为跨膜蛋白，β-catenin一端在膜内与E-cadherin相连接，另一端与γ-catenin相连接，γ-catenin与肌动蛋白相连，构成维持细胞粘附的稳定复合体，表明β与γ-catenin对维持正常上皮组织结构起着重要作用。对上皮源性恶性肿瘤来说，在某些原因作用下发生的β或γ-catenin功能障碍均会破坏癌细胞间的粘着，导致癌细胞间粘附功能被破坏，进而癌细胞脱离肿瘤原发灶。原发灶癌细胞脱落本身并不致命，癌细胞在其他部位再聚集并出现转移灶是主要致死原因。Bukholm等[6]已经注意到乳腺癌患者转移灶内癌组织β-catenin再表达的情况。β-catenin不仅是E-cadherin/catenins复合物作用链中的重要环节，还通过与APC蛋白连接构成第2种非cadherin依赖独立β-catenin复合物，与cadherin/catenins复合物联接，共同介导上皮细胞间粘附[7]。此外,β-catenin是wnt基因家族控制信号传导通路重要成分，在肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、Src基因及C-erb-B2等诱导下通过酪氨酸磷酸化影响E-cadherin、APC或c-myc，改变该复合物活性，进而促进癌细胞侵袭和转移[8,9]。有发现,β-catenin还可以通过Gelsolin蛋白调节人类结肠癌细胞的迁移[10]。

图3 γ-catenin生存曲线

图4 Rb生存曲线

一些研究显示,E-cadherin/catenins复合物在胃癌异常表达率为20%～90%[11,12]。本研究发现，仅极少病例中肿瘤原发灶癌细胞β与γ-catenin正常表达即粘附功能正常。在转移淋巴结内癌细胞β与γ-catenin再表达阳性率远高于原发灶肿瘤细胞正常表达说明，正如β与γ-catenin在肿瘤原发灶癌细胞高不正常表达与癌细胞自肿瘤原发灶脱落相关一样,他们在转移灶的高再表达阳性与癌细胞在转移部位的再聚集和生长有关。肿瘤原发灶中该复合体不正常表达导致癌细胞脱离，在淋巴结较高再表达则造成癌细胞的聚集。而且β与γ-catenin在转移淋巴结再表达呈正相关，说明β与γ-catenin有可能偕同作用于癌细胞于肿瘤原发灶的脱落及在转移淋巴结的聚集。本研究还表明，β与γ-catenin的再表达与患者预后密切相关。

Rb基因位于染色体长臂(13q14)，由27个外显子构成，主要通过抑制转录因子E2F作用于细胞周期，对细胞生长分化有重要调控作用。该基因正常情况下对细胞分裂起抑制作用，如果这种抑制作用减弱将导致细胞的异常增殖，最终导致癌变，其失活方式可分为缺失、突变及、甲基化等。Rb基因对细胞增殖分化的调控与多种因子相关，如cyclins、CDKs、TGF-β2等。还受多种因素如病毒、癌基因及癌基因产物的影响,会干扰其正常功能并导致肿瘤发生[13]。

p16-cyclinD1-pRb与p53-p21-pRb通路是细胞周期G1-S期转变两条独立分子信息传导途径，Rb蛋白对细胞周期调节起重要作用。Rb蛋白功能与磷酸化状态密切相关。磷酸化Rb蛋白与转录因子E2F结合，细胞增殖停滞于G1期，有助于细胞DNA的损伤修复；磷酸化Rb蛋白抑制细胞由G0-G1期转化所必须的c-myc与c-fos癌基因表达。某些原因致Rb蛋白磷酸化水平升高，导致转录因子E2F激活并释放，DNA复制，细胞过度增殖，细胞于G1期未充分发育便进入S期，有可能导致恶性肿瘤的发生[14]。

C-mgc基因是β-Cat-Tcf/lef复合物靶基因[15]。细胞周期素(cyclinD1,CD1)是一种作用于G1期的细胞周期相关蛋白,促进细胞由G1/G0期进入S期。可见Rb与β-catenin对肿瘤在原发灶发生、发展相关。Rb作为一种重要抑癌基因，本应在肿瘤原发灶低表达，但本研究发现，Rb蛋白在肿瘤原发灶65.12%的高表达，理论上讲,Rb蛋白的表达应抑制细胞增殖,不利于肿瘤的发生、发展。但不是所有的Rb突变均可见检验到Rb蛋白缺失,相反可导致一种无功能Rb蛋白,即突变型Rb蛋白表达[16]。有学者证实野生型Rb蛋白有抑制细胞增殖的功能,突变型的Rb蛋白则失去抑制作用[17]。本研究表明，Rb蛋白与β-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达有相关性，即二者有共同作用基因，不仅在肿瘤原发灶作用时有相关性，而且对β-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达也有关系，但具体机制不清。

综上所述，β与γ-catenin功能异常为肿瘤发生、发展过程中的重要环节，并与其他因素共同作用促进肿瘤的发生、发展。在进展期胃癌转移淋巴结癌细胞存在β与γ-catenin再表达，并对肿瘤发展起着重要的作用，而且与患者预后密切相关。Rb蛋白在肿瘤发生、发展过程中起重要作用，而且与β-catenin在转移淋巴结癌细胞再表达有关,与患者预后密切相关。

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ExpressionandclinicalsignificanceofRbprotein,βandγ-catenininmetastaticlymphnodesfromadvancedgastriccarcinoma

ZHANGYulong*,FANXiaoyan,HEDongwei,etal.

*DepartmentofSurgery,TheFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

ObjectiveTo investigate the expression of Rb and re-expression of β and γ-catenin in cancerous cells of metastatic lymph nodes from advanced gastric carcinoma.MethodsThe expression levels of Rb and β and γ-catenin were detected by immunohistochemistry in 86 cases of primary focus of advanced gastric carcinoma as well as corresponding metastasis lymph nodes.ResultsAmong 86 cases of primary focus of advanced gastric carcinoma,the expression of Rb was detected in 56 case (65.12%),and re-expression of β-and γ-catenin in metastatic cancerous cells was detected in 33 case (38.37%). The expression of Rb was closely related with tumor differentiation degree (P<0.05),and the re-expression of β-and γ-catenin was closely correlated to tumor differentiation degree (P<0.05).The re-expression ofγ-catenin in metastatic cancerous cells was closely correlated to tumor pathological types (P<0.05),however, the re-expression of βcatenin in metastatic lymph nodes was not related with tumor pathological types (P>0.05). Moreover the expression of Rb in metastatic lymph nodes was related with that of β-catenin,however,which was not correlated to tumor pathological types,tumor size,infiltration degree (P>0.05). There were significant differences in 3-year survival rates between patients with positive re-expression of β or γ-catenin and patients with negative re-expression ofβ or γ-catenin.ConclusionThe expression of Rb protein is closely related with the progress of advanced gastric carcinoma and with the re-expression of β-catenin in cancerous cells of metastatic lymph nodes.The re-expression of β-and γ-catenin in cancerous cells of metastatic lymph nodes from advanced gastric carcinoma plays an important role in the pathogenesis of advanced gastric carcinoma and both factors have synergistic reaction and play important role in aggregation and growth of cancer cells in metastatic focus.

Rb; β and γ-catenin; advanced gastric carcinoma; metastatic lymph nodes; immunohistochemistry;survival duration

项目来源：河北省卫生与计划生育委员会 (编号：ZD20140160，20130251)

050011 河北省石家庄市第一医院外三科(张宇龙、智英辉)；河北省人民医院肿瘤科(范晓燕、周晔、刘淑贞、蔡建辉)；河北医科大学第四医院临床生物细胞室(何东伟)

范晓燕，050051 石家庄市，河北省人民医院肿瘤科；

E-mail:xiaoyanfan1980@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.19.001

R 735.2

A

1002-7386(2017)19-2885-05

2017-03-20)