不同程度冠状动脉损伤E-选择素基因多态性研究

王丽萍 孙常铭 于海明 朱金伶 李欣欣 华正祥

·论著·

不同程度冠状动脉损伤E-选择素基因多态性研究

王丽萍 孙常铭 于海明 朱金伶 李欣欣 华正祥

目的研究E-选择素血清学水平及其第2外显子G98T和第4外显子A561C基因多态性与不同程度冠状动脉损伤的相关性。方法选取2015年1月至2017年3月诊治的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者及其同期健康体检者为研究对象，采用双抗体夹心方法检测冠状动脉粥样硬化型心脏病组和对照组可溶性血清E-选择素水平，并对不同亚组及其基因型间血清E-选择素水平介导白细胞的渗出对178例冠心病患者和162例健康对照者的E-选择素基因多态性分布情况采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)进行分析。结果冠心病组E-选择素血清水平显著高于对照组 (P<0.01)；冠心病亚组可溶性E-选择素血清水平比较差异有统计学意义(P<0.01)；冠心病3组组间比较，AMI组E-选择素血清水平较SA组高，差异有统计学意义(P<0.05)，但UA、AMI组比较差异无统计学意义(P>0.05)；冠心心病组中E-选择素 G98T基因型GT基因型与GG基因型比较差异无统计学意义(P>0.05)；A561C基因型比较发现AC基因型E-选择素空腹血清学水平高于AA基因型者(P<0.05)；E-选择素 G98T在急性心肌梗死组和心绞痛组间GT与GG基因型的分布差异有统计学意义(χ2=4.030，P<0.05)， GT基因型患急性心肌梗死的风险是GG基因型的2.356倍(OR=2.356，95%CI=1.020～5.442 )。A561C在急性心肌梗死组和心绞痛组间AC与AA基因型的分布差异有统计学意义(χ2=5.426，P<0.05)，AC基因型患急性心肌梗死的风险是AA基因型的2.558 倍(OR=2.558,95%CI=1.160～5.641)。结论不同程度冠状动脉损伤影响E-选择素基因多态性，E-选择素 G98T 和A561C基因多态性与冠心病发病有相关性，并可影响血清E-选择素水平。

冠状动脉粥样硬化性心脏病；E-选择素;基因多态性

disease;E-selectin;gene polymorphism

冠状动脉性疾病是发达国家和发展中国家共同存在的危害人类健康的头号杀手之一，近几年来已成为医学研究、临床医生关注的焦点。据世界卫生组织估计，在中国每年有近700 000多人死于该疾病。冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)是临床最常见的慢性心脏疾病，是全球人类死亡的主要原因之一[1]。冠心病的病理基础主要是冠状动脉发生粥样硬化所致。大量证据表明，炎性反应既可促进冠心病的发生，又可导致冠状动脉血栓形成甚至闭塞，冠状动脉斑块内的炎性反应在冠心病血栓形成中起重要作用[2]。E-选择素作为选择素家族中的一份子，是近年来新发现的一种炎性细胞因子，在炎症形成过程的早期出现，它在动脉粥样硬化斑块的形成过程中起重要作用。目前已经鉴定出一些冠心病易感基因，近年来，冠心病的全基因组关联研究的方法使冠心病易感基因的研究更加快速、可靠，同时有力地推动了冠心病遗传学的发展。因而多方面研究冠状动脉粥样硬化性心脏病在基因发病机制的影响，进而为药物研究、疾病防治和精准治疗是有帮助的。本研究采用酶联免疫吸附试验检测冠心病组和对照组血清E-选择素水平，同时采用PCR-RFLP方法检测E-选择素基因多态性，旨在探讨不同程度冠状动脉损伤对E-选择素基因多态性的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究中均选自2015年1月至2017年3月于承德医学院附属医院心血管内科及老年病科诊治的冠状动脉粥样硬化型心脏病患者(冠心病组)178例，其中男108例，女70例;平均年龄(61.20±12.27)岁。根据中华医学会血管病分会制定的《冠状动脉粥样硬化性心脏病诊断标准(2010)》。纳入标准：(1)患者在劳累后出现持续性1～5 min的胸后方疼痛，并放射在左上肢和肩部；(2)发病心电图可见暂时的T波倒置或ST段下移；(3)经冠状动脉造影可见动脉狭窄或阻塞程度>50%；(4)感染患者经实验室检测结果为阳性。同时又对以上研究对象分为下列亚组:(1)急性心肌梗死(AMI)组58例，男32例，女24例；平均年龄(60.20±11.27)岁；根据临床症状，持续剧烈胸痛>30 min以上，十二导联心电图的动态演变，心肌标志物阳性确诊，发病24 h以内。(2)不稳定型心绞痛(UA)组60例，男28例，女32例；平均年龄(61.03±10.47)岁；有静息性心绞痛或近一个月内新发心绞痛，胸痛<30 min；心绞痛发作时间内，心电图出现明显的ST段缺血性压低，范围>1 mm，呈暂时性发作，症状缓解后，迅速恢复或接近正常；心肌标志物正常水平；并距离末次发作时间在24 h以内。(3)稳定型心绞痛(SA)组60例，男31例，女29例；平均年龄(60.86±11.46)岁；其表现在2个月内无明显改变，运动试验呈现阳性，并且有劳累性心绞痛发作史。UA组和SA组为心绞痛组。对照组162例，男92例，女70例；平均年龄(60.73±12.06)岁；为同一时期体检科体检人员随机选取，心电图检查正常，无肝肾疾病、无心脑血管、内分泌等疾病。

1.2 纳入标准 以上所有研究对象无血缘关系，所选病例无先天性心脏病、心肌病、心内膜炎；无严重肝脏、肾脏、呼吸系统疾病患者；无外恶性肿瘤、脑血管疾病、自身免疫性疾病；1年内未进行心脏介入手术等患者。所有受试者知情同意。

1.3 方法

1.3.1 全血基因组DNA提取:取EDTA 抗凝剂的外周静脉血5 ml，用盐析法提取基因组DNA，并置于-20℃冰箱保存。

1.3.2 引物设计与合成:PCR引物用Primer 5设计，引物由Thermo Fisher公司合成。引物序列如下：用于扩增E-selectin 第2外显子 G98T基因多态性位点的一对引物：5′-TGCCCAAAATCTTAGGATAC-3′；5′-AAGCCCAGGGAAGAACACAT-3′；用于扩增E-selectin 第4外显子A561C基因多态性位点的一对引物：5′-AGTAATAGTCCTCCTCATCATG-3′；5′-ACCATCTCAAGTGAAGAAAGAG-3′。

1.3.3 PCR扩增条件:PCR扩增反应体系为30 μl，其中基因组DNA 3 μl，正、反向引物各2 μl，Taq DNA聚合酶 0.5 μl，10×PCR buffer 3 μl，dNTPs 2 μl，MgCl22 μl，双蒸水15.5 μl。以上产物混合后置热循环仪上：预变性：95℃ 5 min；变性：95℃ 30 s；复性：58℃ 1 min；延伸：72℃ 1 min。共30个循环，最后72℃延伸12 min冷却到4℃。

1.3.4 扩增产物的限制性酶切:取PCR扩增产物15 μl，G98T基因扩增产物用限制性内切酶HphI进行酶切，A561C基因扩增产物用限制性内切酶Pstl进行酶切。37℃孵育4.0 h反应结束后，用3%琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳,用自动凝胶成像系统成像。

1.3.5 E-选择素血清学水平测定:采用双抗体夹心法检测冠心病组和对照组血清E-选择素水平。

2 结果

2.1 冠心病组与对照组血清可溶性E-选择素水平比较 冠心病组与对照组比较，E-选择素血清水平组间差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2 冠心病亚组可溶性E-选择素血清水平比较 SA、UA、AMI 3组分别与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；冠心病3组组间比较，AMI组E-选择素血清水平较SA组高，差异有统计学意义(P<0.05)，但UA、AMI组比较无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组别可溶性E⁃选择素χ2值P值冠心病组(n=178)59．3±7．6对照组(n=162) 34．6±8．24．1260．032

组别可溶性E⁃selectin对照组(n=162)33．8±7．7SA组(n=60) 46．4±6．3∗△UA组(n=60) 60．1±8．0∗#AMI组(n=58) 69．2±7．2∗#

注:与对照组比较，*P<0.05；与SA组比较，#P<0.05；与UA组比较，△P<0.05

2.3 不同基因型间E-选择素血清学水平比较 冠心病组中E-选择素 G98T基因型GT基因型与GG基因型比较差异无统计学意义(P>0.05)；A561C基因型比较发现AC基因型E-选择素空腹血清学水平高于AA基因型者(P<0.05)。见表3。

表3 不同基因型E-选择素血清学水平比较 μg/L

2.4 E-selectin基因G98T、A561C PCR产物酶切结果 E-Selectin第2外显子 G98T PCR扩增产物片段长度为332 bp，用限制性内切酶Hphl酶切后可发现基因型有3种，GG型两条带(138 bp、194 bp)，GT型三条带(194 bp、138 bp、332 bp)。E-selectin 第4外显子A561C PCR扩增产物片段长度为186bp，用限制性内切酶Pstl酶切后发现基因型有3种方式，AA型两条带(123 bp，63 bp)，AC型三条带(186 bp，123 bp，63 bp)。本实验均未检测到一条带现象。见图1、2。

2.5 AMI组与心绞痛组E-选择素基因型比较

2.5.1 E-选择素第2外显子G98T在AMI组和心绞痛组间GT与GG两个基因型的分布进行统计分析后显示差异有统计学意义(χ2=4.028，P<0.05)；相对风险性统计分析结果表明，GT基因型患急性心肌梗死的风险是GG基因型患者的2.227倍(OR=2.227，95%CI=1.020～5.442)。见表4。

图1 HphI限制性内切酶酶切G98T位点结果

图2 Pstl限制性内切酶酶切 A561C位点结果

注：1：100～2 000 bpMarker；1～2 PCR产物；3～4为AA型两条带；5～6为AC型三条带

2.5.2 E-选择素第4外显子A561C在AMI组和心绞痛2组比较，AC基因型与AA基因型的分布差异有统计学意义(χ2=5.368，P<0.05)；分布频率的相对风险性分析结果显示：GT基因型患者患急性心肌梗死的风险是GG基因型患者的2.368倍(OR=2.368,95%CI=1.160～5.641)。见表5。

表4 冠心病亚组E-选择素 G98T基因型比较 例(%)

表5 冠心病亚组E-选择素 A561C基因型比较 例(%)

3 讨论

冠状动脉粥样硬化性心脏病指冠状动脉粥样硬化使冠脉血管内腔狭窄或阻塞，引起心肌缺血、缺氧，它和冠状动脉痉挛一起统称为冠状动脉性心脏病[3]。冠心病患者主要症状是表现为胸前区压榨性疼痛，常迁延至手臂、颈部及胃部，常由体力劳动或情绪激动所激发，发作时表现为心绞痛和不稳定性心绞痛，严重患者发作期可能诱发心肌梗死，患者由于心力衰竭而死亡。目前冠心病是世界上公认的发病率和病死率都很高的一类疾病，并且日益年轻化，这给人们的生活带来了极大的负担。国内外学者把冠心病看作是一种多风险因素，也就是说环境因素及遗传易感基因共同的作用所导致了这类疾病的发生[4]。

动脉粥样硬化斑块的形成是冠心病的发病基础，它是一种慢性炎症性疾病，慢性炎症加速了冠状动脉粥样硬化的发生发展。目前，对冠心病的病因的研究主要集中在以下两个方面：从宏观水平寻找疾病发生的危险因素和从微观水平探讨冠心病发病的遗传基因，近几年来对冠心病易感基因的研究是成为了众多学者关心的热点方向。冠状动脉斑块破裂随之发生的血小板聚集和血栓形成也是导致冠状动脉粥样硬化发生的重要机制之一，75%的冠状动脉粥样硬化是不稳定斑块所致。病理学研究表明，动脉粥样硬化斑块区有大量炎性细胞的浸润，这多发生的部位在破裂斑块的“肩区”以及脂质核心部位，这表明了炎性反应参与了冠状动脉粥样硬化的发生及发展的整个过程[5]。大量的研究结果表明，白细胞黏附因子是炎症最早出现的一类因子，可作为动脉粥样硬化的一个重要标记分子[6]，在单一部位或全身性炎症疾病时，动脉粥样硬化斑块的形成起着至关重要的作用。

E-选择素在结构上是由多种配体组成的，其中包括唾液酸化路易糖a、唾液酸化路易糖X和以及一些相关的寡聚糖等[7,8]。在静息时刻，内皮细胞上含量不多，而当内皮细胞受炎性因子TNF-α、IL-1、细菌脂多糖(LPS)以及AngⅡ等因子刺激后，血清可溶性E-选择素的水平表达急剧增加。经相关学者研究证实，组织发生炎性反应时会导致冠状动脉粥样硬化的斑块发生表现出不稳定状态，这也是急性心肌梗死发病的的主要因素之一[9]。血清可溶性E-选择素是由黏附分子的胞外部分的酶裂解而来的，包括白细胞、血管内皮细胞或其他多种细胞的表面因子，裂解后的酶使胞外部分脱落进入血液循环导致了疾病的发生。可溶性血清E-选择素介导白细胞的渗出，使白细胞紧密的黏附于内皮表面，同时黏附和聚集多种白细胞和T细胞及其亚群，而此种黏附聚集恰恰正是动脉粥样硬化斑块形成的重要机制[10]。

相关研究表明E-选择素可能参与了疾病的发生和发展，冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的血清可溶性E-选择素水平表达增加[11]。Guray等[12]做过类似报道，提示E-选择素参与老年冠心病的发生发展。Foglieni等[13]发现与稳定型心绞痛比，急性冠脉综合征的乳房内动脉内皮表达E-选择素等炎性指标明显增高。为了进一步研究E-选择素基因型与冠心病严重程度的相关性，我们对试验对象进行了分组，分为冠心病急性心肌梗死组及心绞痛组，结果显示：在急性心肌梗死组和心绞痛组间GT与GG和 AC与AA基因型的分布均存在显著性差异，这说明动脉粥样硬化性心脏病的严重程度与E-选择素基因型的分布密切相关。

研究表明，冠状动脉粥样硬化性心脏病患者外周血中血清可溶性E-选择素的水平升高程度与冠状动脉粥样硬化的病变程度呈明显的相关性，血清可溶性E-选择素水平可能在疾病的发生、发展过程与冠状动脉粥样硬化的形成中起重要作用[14]。国内学者田乃亮等[15]研究结果提示冠心病的sE-选择素水平明显增高，且在不同程度冠心病损伤程度上差异显著，此研究说明血清E-选择素水平的升高程度与冠状动脉粥样硬化性心脏病的病变程度有相关性，其水平的高低会影响的疾病的发生发展程度。研究发现在心肌梗死时给予E-选择素等的单克隆抗体治疗可以减少心肌梗死的范围。同时我国学者杨立森等[16]也研究发现冠状动脉粥样硬化患者E-选择素水平呈现升高的趋势，并且升高的水平与疾病的严重程度正相关，这可作为鉴别胸痛患者怀疑冠心病的临床辅助检查手段之一。当然也有学者持不同意见。但也有一种观点认为AMI和UA患者的血清可溶性E-选择素水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，但相较SA组水平要高，相比较对照组水平也明显增高。早期国外学者Blann等[17]研究报道，局部缺血性心脏病其可溶性血清E-选择素水平呈现增高趋势，这表明E-选择素水平的增高是发生动脉粥样硬化的危险因素之一。

本试验研究结果表明：可溶性E-选择素血清水平在冠状动脉粥样硬化患者组和对照组比较前者呈显著增高水平，但在UA组、AMI组比较差异无统计学意义(P>0.05),这说明尽管UA和AMI的病情严重程度不同,但两者冠状动脉内皮细胞的激活程度是相当的。本试验研究结果与Talar等[18,19]的研究结论大体上一致，以上结果也表明：冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的血清E-选择素水平的升高表明了缺血心肌组织发生了急性炎性反应，可溶性血清E-选择素水平可用于评价冠状动脉粥样硬化斑块是否稳定及其稳定程度，这对于疾病的进展情况判定有重要鉴别意义。而目前对于E-选择素基因型分分布是否影响E-选择素血清学水平，目前尚无定论[20]。我们的研究结果显示：在冠心病组中血清E-选择素水平G98T基因位点比较差异无统计学意义(P>0.05),但A561C基因位点AC基因型高于AA基因型者，这提示E-选择素第4外显子A561C基因多态性在内皮细胞上的表达和基因结构相互关联，其水平的高低会影响疾病的程度，同时也会引起蛋白质功能的变化导致冠心病的发生发展，这与国外著名学者田乃亮等[15]的E-选择素基因型对血清E-选择素水平有影响在理论上观点是一致的。

综上所述，血清可溶性E-选择素水平在冠状动脉粥样硬化斑块形成过程中不同程度的表达，冠状动脉损伤程度越严重，其表达水平越高，E-选择素基因多态性分布与冠脉损伤程度也呈正相关趋势，因此临床上检测可溶性E-选择素血清学水平并且进一步研究基因多态性分布有助于判断冠心病患者的病情程度及进展情况。而目前研究尚处于初级阶段，因而还需要我们进行大样本、多地域、多民族广泛深入的协同研究。

1 魏峰,郑若龙,李伟章,等.冠心病患者冠状动脉病变严重程度与相关危险因素分析.宁夏医科大学学报，2014,36:677-679.

2 杨晓宇,潘娟，杨玲.早发冠心病患者合并高甘油三酯腰围表型的临床意义.中国心血管病研究，2015,13:232-235.

3 El -Shinnawi L,Soory M.Associations between periodontitis and systemic inflammatory diseases:response to treatment.Rrdocr Metab luamurre Drug Discau,2013,7:169-188.

4 Liou K,Jepson N,Kellar P,et al.Prognostic Significance of Peri-procedural Myocardial Infarction in the Era of High Sensitivity Trop-nin:A Validation of the Joint ACCF/AHA/ESC/WHF universal Definition of Type 4a Myocardial Infarction with High Sensitivity Troponin T.Heart Lung Circ,2015,24:673-681.

5 张蕴莉,唐甜甜,方伯言.E-选择素S128R基因多态性与脑血栓形成遗传易感的关系.中国现代医学杂志,2009,14:123-126.

6 胡龙才,张卫,李伟龙,等.E-选择素S128R基因多态性与中国人群冠心病发病相关性的Meta分析.中国循证心血管医学杂志,2016,8:23-24.

7 Kannagi R,Lzawa M,Koike T,et al.Carbohydrate-mediated cell adhesion in cancer metastasis and angiogenesis.Cancer Sci,2004,95:377-384.

8 Kitayama J，Tsunami E.E-selectin can mediate the arrest type of adhesion of colon cancer cells under physiological shear flow.Eur J Cancer,2000,36:121-127.

9 Roffi M，Patrono C,Collet JP,et al.2015 ESC guidelines for the management of acute coronary syndromes in patients presenting with-out persistent ST-segment elevation; Task Force for the Management of Acute Coronary Syndromes in Patients Presenting without Persistent S'1'-Segment L;levation of the L;uropean Society of Cardiology(ESC).Gur Heart J,2015,37:267-315.

10 梁丽丽,蔡梦云,周萌媛.CTRP9基因多态性与冠心病的相关性.中国老年学杂志,2017，1:67-68.

11 高敏.E-选择素与心血管疾病.医学综述，2006,12：60-62.

12 Guray U,Erbayn AY.Levels of soluble adhesion molecules in Various clinical presentations of coronary atheroslerosis.Int J Cardiol,2004,96:235-240.

13 Foglienl C,Maisano F,dreas L,et al.Mild inflammatory activation of mammary arteries in patients with acute coronary syndromes.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008,294:H2831-2837.

14 杨大春,朱峻,周兴文,等.冠心病炎症标志物检测的意义.临床心血管杂志,2004,20:123.

15 田乃亮，陈绍良，马玉玲，等.血清E-选择素在冠心病中的变化及意义.中国结合临床，2005,21：876-878.

16 杨立森,林媛豪,石学宁,等.可溶性 Es 对冠心病心绞痛的诊断意义.临床心血管病杂志,2003,19:272-274.

17 Blann AD,Amiral J,Mccollum CN.Prognostic value of increased soluble thrombo modulinand increased soluble E-selectin in ischemic heart disease.Eur J Haematol,1997,59:115-120.

18 Talar EA,Ytem KA,Haznedaroglu I,et al.Increased levels of soluble selectins in patients with unstable angina.Int J Cardiol,2001,78:69-73.

19 Suefuji H,Ogawa H,Yasue H,et al.Increased plasma level of soluble E-selectin in acute myocardial infarction.Am Heart J,2000,140:243-248.

20 Rauchhaus M,Gross M,Schulz S,et al.The E-selectin Ser128Arg gene polymorphism and restenosis after successful coronary angioplasty.Int J Cardiol,2002,83:249-257.

StudyonE-selectingenepolymorphismindifferentdegreeofcoronaryarterylesion

WANGLiping*,SUNChangming,YUHaiming,etal.

*DepartmentofBloodTransfusion,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollage,Hebei,Chengde067000,China

ObjectiveTo investigate the serum levels of E-selectin and the correlation between the second exon A561C and the fourth exon G98T gene polymorphism of E-selectin and different degree of coronary artery lesion.MethodsA total of 178 patients with coronary atherosclerotic heart disease who were diagnosed and treated in our hospital from Januaty 2015 to March 2017 were enrolled as coronary heart disease group (CHD group),meanwhile,the 162 health examination subjects were enrolled as control group.The E-selectin levels were detected by double antibody sandwich method,and E-selectin gene polymorphism distribution status was analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP).ResultsThe serum level of E-se1ectin in CHD group were significantly higher than those in control group (P<0.01). There were significant differences in serum soluble E-selectin levels among CHD subgroups (P<0.01).Among the three CHD groups,the serum levels of E-selectin in acute myocardial infarction (AMI) group were significantly higher than those in SA group (P<0.05),but there were no significant differences between UA group and AMI groups (P>0.05). In CHD group,there was no significant difference between G98T genotype,GT and GG genotype of E-selectin (P>0.05).The A561C genotype comparison showed that the fasting serum levels of E-selectin of AC genotype were significantly higher than those of AA genotype (P<0.05).There was significant difference in GT and GG genotype distribution in G98T genotype of E-selectin between AMI group and angina pectoris group (P<0.05),The risk of AMI in patients with GT genotype was 2.356 times as high as that of GG genotype (OR=2.356,95%CI=1.020～5.442 ).There was significant difference in the distribution of AC and AA genotype of A561C between AMI group and angina pectoris group (P<0.05).The risk of AMI in patients with AC genotype was 2.558 times as high as that of AA genotype (OR=2.558,95%CI=1.160～5.641).ConclusionThe different degree of coronary artery injury may affect E-selectin gene polymorphism,the G98T and A561C gene polymorphisms are correlated to pathogenesis of coronary heart disease,which may

also influence the serum levels of E-selectin.

coronary atherosclerotic heart

067000 河北省承德市，承德医学院附属医院输血科(王丽萍、华正祥)，检验科(孙常铭)；河北省平泉县医院检验科(于海明)；河北省滦平县医院检验科(朱金伶)；河北省宽城满族自治县医院检验科(李欣欣)

华正祥，067000 河北省承德市，承德医学院附属医院输血科；

E-mail:78001625@qq.com

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.19.003

R 541.4

A

1002-7386(2017)19-2893-05

2017-05-11)