双点突变对猪链球菌2型溶血素活性的影响

刘 爽，张秀娟，张兴进，宫枫举，潘子豪，马 喆，孙学强，，

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2. 青岛立见诊断技术发展中心，山东青岛 266114；3. 南京农业大学，江苏南京 210095）

双点突变对猪链球菌2型溶血素活性的影响

刘 爽1，张秀娟1，张兴进2，宫枫举2，潘子豪3，马 喆3，孙学强1，2，3

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2. 青岛立见诊断技术发展中心，山东青岛 266114；3. 南京农业大学，江苏南京 210095）

猪链球菌2型作为一种人兽共患病病原，日益受到关注。而溶血素是其分泌的外毒素，是公认的重要毒力因子之一，具有良好的免疫原性。本试验通过PCR方法获得猪链球菌2型野生型溶血素基因sly和463、464双点突变的溶血素突变体基因slym。将sly和slym克隆至表达载体，构建了2个重组载体并在大肠杆菌中表达了野生型溶血素rSLY和突变型溶血素rSLYm。经过蛋白杂交试验，证明表达的rSLY和rSLYm与提取的猪链球菌的天然野生型SLY分子量完全一致。以提取的野生型SLY为对照，通过溶血试验证明，突变型溶血素rSLYm失去了溶血活性；通过接种PK15、RK13、SUVEC细胞单层，证明突变型溶血素rSLYm失去细胞毒性；通过小鼠试验，证明突变型SLYm对小鼠没有毒力。本试验通过溶血试验、细胞接种和小鼠实验，证明双点突变灭活了野生型溶血素的溶血活性、细胞毒性和小鼠毒力。该溶血素突变体经免疫实验证实后，可作为猪链球菌2型亚单位疫苗的候选抗原。

猪链球菌2型；溶血素；突变；溶血活性；细胞毒性

猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2，SS2）可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎，并致人链球菌毒素休克综合征等[1]。溶血素又称猪溶素（Suislysin，SLY）是猪链球菌2型重要的毒力因子之一。从病猪中分离到的个别SS2菌株因缺乏SLY，所以对其致病过程中的作用机制不甚清楚。但是Jacobs等[1]用提纯的SLY免疫动物后进行攻毒保护，发现动物仅出现温和症状；Liu等[2]的报道也说明SLY是SS2的重要保护性抗原；Lun等[3]研究认为，SS2溶血素在刺激细胞因子的释放和起始免疫过程中具有重要作用。猪链球菌溶血素属巯基活化的溶细胞素家族（TACY）溶血素[4]。该家族的链球菌溶血素O（Streptolysin，SLO）、产气荚膜梭菌溶血素O（Perfringolysin O ）、李斯特菌溶血素O（Listeriolysin O）和肺炎链球菌溶血素（Pneumolysin，PLY）都能够裂解细胞膜富含胆固醇的靶细胞[5]。SLY为单链多肽，所以少量的硫醇基结合物可使半胱氨酸转变成二硫化物，因此阻碍了毒素与膜的结合[6]。如果除去还原物，溶血素就可恢复活性。链球菌溶血素SLO的C端含有高度保守的疏水氨基酸，其与膜结合有关[7]；N端的70个残基（1/8的分子量）可以被除去而不损害其生物活性。单体SLO的结合是在周围温度较低的环境下进行的，并且迅速可逆。C端在结合中起到关键作用，只要切断C端的两个残基，就能使结合能力消失[8]。Michel等[9]在研究同属硫醇活性胆固醇结合细胞溶素家族的李斯特溶血素时，分别将李斯特菌溶血素（LLO）的491和492位Trp突变为丙氨酸后，构建含有LLO突变体质粒的李斯特菌，经试验证明突变491-Trp溶血活性下降95%，突变492-Trp溶血活性下降99.9%。本试验根据溶血素氨基酸序列比对，将Trp-463和Trp-464突变，使溶血素的活性显著降低，构建没有生物活性，同时最大限度保留其空间结构的溶血素突变体，将其作为SS2候选亚单位疫苗。

1 材料和方法

1.1 菌株、抗体、酶和细胞

猪链球菌2型HA9801株，PK15、RK13、SUVEC细胞等，由本实验室保存；猪链球菌2型溶血素单克隆抗体，由华中农业大学金梅林教授馈赠；ZY05719感染猪康复血清，由本试验采集保存；硝酸纤维素膜及电泳试剂等，为Sigma公司产品；核酸胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、HRPSPA、增强型HRP-DAB底物显色试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Taq酶、限制酶，购自宝生物（大连）工程有限公司。

1.2 重组野生型和突变型溶血素表达载体的构建

根据GenBank公布序列DQ443530设计扩增引物和突变引物，以猪链球菌2型HA9801株基因组为模板，扩增获得猪链球菌2型野生型溶血素基因sly；以突变引物扩增获得463位和464位色氨酸突变为丙氨酸的突变型溶血素基因slym。然后将sly和slym双酶切，定向克隆至pET28a（+）表达载体后，构建重组表达载体，转化DH5α感受态细胞，并在含有卡那霉素的LB琼脂平板上进行筛选。对经过PCR和酶切鉴定的阳性克隆进行测序分析正确后，转化Rosetta表达宿主菌，用卡那氯霉素双抗性平板进行筛选。

1.3 天然野生型、重组野生型和突变型溶血素的提取、诱导表达及鉴定

参照陈国强等[10]的方法，提取HA9801分泌的天然野生型溶血素命名为SLY。

将鉴定正确的重组表达载体转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞后，各挑选1株，接种含有卡那氯霉素的LB液体培养基；振荡过夜后，按照2%体积接种含有卡那氯霉素双抗性LB液体培养基；振荡培养4 h后，加入IPTG诱导3 h；离心取沉淀，超声波破碎，12 000 g 4 ℃离心，取上清蛋白分别命名为rSLY和rSLYm；将各样本按照常规方法进行SDS-PAGE，采用半干法转印至NC膜，然后用5%的脱脂奶封闭过夜；转印膜在含有20 µL SLY单抗的20 mL TBST中37 ℃孵育1 h，然后用TBST洗涤2次；HRP-SPA 37 ℃反应1 h后，用TBST洗涤2次；用DAB显色约30 s，终止反应，晾干观察。

1.4 溶血活性试验

将rSLY和rSLYm用Thermo NanoDrop 2 000测定总蛋白含量。参照Gottschalk等[11]的方法，各取0.5 mL，加入2.5 M的二硫代苏糖醇（DTT）至终浓度为5 mM；室温孵育30 min后，分别用0.5 mL PBS进行倍比稀释；加入0.5 mL 2%（V/V）的兔血红细胞，同时设0.5 mL超纯水阳性对照和PBS阴性对照；颠倒混匀后，37 ℃静置孵育1 h，6 000 g 离心5 min；分别取各样本200 µL上清，用分光光度计测定A540。在PBS阴性对照不溶血，即A540约为0的条件下，以吸光值达到超纯水阳性对照的50%，为1个溶血活性单位，计算各样本的溶血活性单位。

将溶血活性单位为214的rSLY，用PBS进行稀释后，在96孔板上，每孔加入50 µL，然后分别加入感染ZY05719康复猪血清和抗SS2溶血素单抗进行倍比稀释，再加入50 µL 1%（V/V） 的兔红细胞，同时设PBS阴性对照；37 ℃静置孵育至对照孔内红细胞全部沉淀，观察溶血现象，并以100%红细胞发生溶血为溶血抑制滴度。

1.5 细胞毒性试验

将蛋白含量为5.1 mg/mL、溶血活性单位为212的rSLY和蛋白含量为7.7 mg/mL的 rSLYm各取0.5 mL，用无血清的MEM进行倍比稀释至212；各取200 µL分别覆盖24孔板内的RK13、PK15和猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）单层细胞，在37 ℃ 5% CO2条件下孵育，每隔10 min观察1次。

1.6 小鼠毒力实验

将24只体重约20 g的4周龄Bal/bc小鼠，随机分为8组。将蛋白含量为5.1 mg/mL，含有214溶血单位的rSLY，用无菌PBS做2、4、10和20倍稀释。将第1、2和3组小鼠，每只分别腹腔注射0.5 mL经2、4和10倍稀释的rSLY；将第4组小鼠，每只分别腹腔注射0.5 mL蛋白含量为7.7 mg/mL rSLYm。12 h内观察各组小鼠的活动、采食、饮水及精神状态等，对死亡小鼠，立即解剖观察脏器变化。将第5、6和7组小鼠，分别用4、10和20倍稀释的rSLY尾静脉注射200 µL/只；将第8组小鼠，注射等体积未经稀释的rSLYm。注射后观察12 h内各组小鼠的精神状态、行动、呼吸等，并统计死亡数量，对死亡小鼠立即解剖观察脏器变化。

2 结果

2.1 重组野生型和突变型溶血素表达载体的构建

以猪链球菌2型HA9801株基因组为模板，分别扩增获得长度为1 400 bp的猪链球菌2型野生型溶血素基因sly和突变型溶血素基因slym（图1）。以BamHI、NcoI双酶切构建的重组表达载体，经PCR、双酶切和测序鉴定均正确。

图1 PCR扩增重组野生型和突变型溶血素基因电泳图谱

2.2 天然野生型、重组野生型和突变型溶血素的提取、诱导表达及鉴定

重组野生型和突变型溶血素阳性表达菌株经IPTG诱导的菌体制备的蛋白样本rSLY和rSLYm，经过SDS-PAGE，均出现与天然野生型溶血素SLY分子量一致的，约56 kD的蛋白条带，且丰度较高；Western-blot结果表明，所构建重组野生型和突变型溶血素表达载体均能表达出与SLY单抗发生特异性反应的重组蛋白；天然野生型SLY在56 kD附近出现单一的、清晰的杂交条带（图2）。

图2 天然野生型、重组野生型和突变型溶血素Western-blot图谱

2.3 溶血活性及抑制试验

用Thermo Nano Drop 2 000测定制备的rSLY、rSLYm总蛋白含量分别为5.1 mg/mL、7.7 mg/mL。参照Gottschalk等[11]的方法，测定提取的HA9801天然野生型SLY溶血活性单位含量为212（图3-A），重组野生型rSLY为214，但重组突变型rSLYm在蛋白含量相同的情况下不能溶解同等条件下的兔红细胞；ZY05719感染猪康复血清的溶血抑制滴度达到了210（图3-B）。同等条件下溶血素单克隆抗体不能抑制天然野生型溶血素溶血。

图3 天然野生型溶血素溶血及溶血抑制试验

2.4 细胞毒性

对经活化的rSLY和rSLYm倍比稀释后，分别覆盖96孔板内单层RK13、PK15和SUVEC，37 ℃孵育2 h后，在倒置显微镜下观察可以发现，接种rSLY的RK13、PK15和SUVEC细胞，在接种20 min后均出现细胞病变：立体感消失、细胞间隙折光性增强、核极化等（图4-A）。随着作用时间的延长，所有出现病变的细胞最后均崩解、脱落。所制备的rSLY对3种细胞的CPE效价分别为26、27、29；接种SLYm的细胞（图4-B）与对照细胞（图4-C）均未出现任何病变。

图4 重组野生型和突变型溶血素的细胞毒性

2.5 小鼠毒力试验

攻击rSLY的第1、2和3组小鼠在3～4 h内均出现被毛蓬松、扎堆、颤抖、精神萎靡等现象，12 h后第1组死亡2只，其它均康复。解剖死亡小鼠发现，腹腔内脏器如肠、脾脏、肝脏等均出现严重出血。第5、6组的6只和第7组的1只，共7只小鼠攻击后立即出现被毛蓬松、搔鼻、呼吸急促、腹式呼吸、眼球凸出、后肢麻痹、大小便失禁等现象，15 min内死亡；第7组的2只虽然出现上述症状，但20 min后逐渐恢复正常（表1）。腹腔注射rSLYm的第4组小鼠未出现任何不良反应；静脉注射rSLYm的第8组小鼠仅出现短时间的扎堆、运动减少现象，但很快恢复，试验期间均未出现死亡。

表1 重组野生型和突变型溶血素小鼠毒力试验

3 讨论和结论

猪链球菌已经成为危害养猪生产及人类健康的重要人兽共患病病原，目前其耐药性日益增强，已对多种抗生素不敏感。免疫预防是防制猪链球菌病的重要措施。Quessy等[12]用无毒株作为活疫苗免疫5组小鼠后，用不同来源的5株强毒株进行攻击，结果4组全部保护；Busque等用该无毒株免疫猪，同样也获得了保护。Kebede等[13]研制猪链球菌2型的温和敏弱毒株疫苗免疫小鼠，只获得了同源保护。国内猪链球菌2型研究和应用相对比较成功的灭活疫苗是姚火春等[14]在1998年分离自江苏海安的HA9801株。基因工程亚单位疫苗又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗，其只含有病原体的1种或几种抗原，而不含有病原体的其他遗传信息。亚单位疫苗不含感染性组分，因而无须灭活，也无致病性。随着分子生物学技术的日渐成熟和猪链球菌2型毒力基因以及保护性抗原的逐渐发现，国内开展表达SS2亚单位的研究工作及报道日渐增多。荚膜多糖（CPS）、溶血素、MRP和EF等是SS2的重要毒力因子，这已经得到共识。尤其是溶血素作为SS2分泌到细胞外的一种重要的外毒素，具有良好的免疫原性，其做为亚单位疫苗免疫动物抵抗SS2感染具有重要意义。

随着蛋白结晶技术的发展，溶细胞素家族成员的空间结构大多已研究清楚。Xu等[10]报道溶血素单体富含β片层，可分为4个结构域：结构域1～3在一级结构上是连续的，结构域4是由C端多个β片层反复折叠构成。而富含Trp的“CTGLAWEWWR”基序位于结构域4中的β5和β6片层的相连部位，构成了膜结合位点，尤其是Trp464的位置和方向被认为是与细胞膜上胆固醇结合的主要位点。本试验中Trp464突变为Ala464灭活溶血素的细胞穿孔活性也进一步证实了这一点。将SLYm氨基酸序列提交至I-TASSER（http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER）进行空间结构预测，结果与SS2溶血素（DOI:10.2210/ pdb3hvn/pdb）结构相似性达到98%（图5）。在抗胞外寄生菌感染过程中，体液免疫的作用占主导地位，主要通过抗体中和细菌毒素、激活补体系统以及调理巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞进行非特异性吞噬清除进入体内的细菌。产生抗体的B淋巴细胞主要识别抗原的构象表位，因此重组亚单位疫苗能否最大限度地保留天然构象对于诱导产生具有中和活性抗体具有决定作用。

图5 重组突变型溶血素与野生型溶血素3D结构预测示意图

重组野生型溶血素通过腹腔注射和尾静脉注射均能致死小鼠。但是腹腔注射应用剂量相对较大，观察时间较长，而且小鼠个体差异较大，导致结果不稳定；而静脉注射虽然操作难度大，但是应用剂量较低，且可在30 min内判定免疫效果，因此小鼠可以作为攻毒保护模型，来评价溶血素重组蛋白或者重组活病毒疫苗的免疫效果。本实验通过2个氨基酸的点突变，灭活了溶血素的细胞穿孔毒性，同时又最大限度地保证了突变型和野生型溶血素的空间结构的相似性，因此该重组突变型溶血素具有作为亚单位疫苗的潜力。

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（责任编辑：朱迪国）

Infuence of Double Positions Mutant of Streptococcus suis Serotype 2 Suilysin to Its Hemolytic Activity

Liu Shuang1，Zhang Xiujuan1，Zhang Xingjin2，Gong Fengju2，Pan Zihao3，Ma Zhe3，Sun Xueqiang1，2，3
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Qingdao Regen Diagnostics Development Center，Qingdao，Shandong 266114；3. Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095）

Streptococcus suis serotype 2（SS2）is a zoonosis pathogen and of more and more concern. Suilysin（SLY）is a well-known antigenic virulence factor that secreted by SS2 to the extracellular environments，which has good immunogenicity. In this study，the wild type sly gene and mutant slym gene which has position 463 and 464 mutations were amplified by PCR. Then these genes were inserted into expression plasmids and two E. coli expression systems were constructed respectively. These two systems might express wild type rSLY or rSLYm. The proteins hybrid results showed that rSLY and rSLYm had same molecular weight with the natural wild type SLY. Compared with rSLY，Hemolytic test indicated rSLYm lost its hemolytic ability. Cytotoxicity test with K15，RK13 and SUVEC monolayer cell showed that rSLYm also lost cytotoxicity. Based on mice test，it was failed to prove that rSLYm could induce mouse death. With these Hemolytic test，Cytotoxicity test and animal test，it was demonstrated that mutant rSLYm could be considered as a candidate subunit vaccine antigen of SS2.

Streptococcus suis serotype 2；Suilysin；mutation；hemolyticity；cytotoxicity

S852.65+9.5

B

1005-944X（2017）09-0087-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.09.024

科技部科技基础性工作专项（2012FY111000）