陕西宁强铅锌尾矿中细菌的分离、鉴定及金属离子耐受性评价

罗 强， 解修超,2， 陈文强,2， 邓百万,2，彭 浩,2， 姜午春， 田越欣

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000; 2.陕西理工大学 陕西省食药用菌工程技术研究中心， 陕西 汉中 723000)

陕西宁强铅锌尾矿中细菌的分离、鉴定及金属离子耐受性评价

罗 强1， 解修超1,2， 陈文强1,2， 邓百万1,2，彭 浩1,2， 姜午春1， 田越欣1

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000; 2.陕西理工大学 陕西省食药用菌工程技术研究中心， 陕西 汉中 723000)

对陕西宁强铅锌尾矿附近土壤中的细菌进行分离，研究铅锌尾矿附近细菌对重金属离子耐受性，为铅锌尾矿污染地区微生物资源的研究提供理论依据。采用稀释涂布法对细菌进行分离纯化，然后进行16S rRNA序列扩增与校准并构建系统发育树。选择4种金属离子(Pb2+，Cu2+，Hg2+，Zn2+)对菌株进行耐受性研究。结果表明：从尾矿土壤中共分离纯化出12株细菌，结合形态学与16S rRNA测序结果，所得菌株分属葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、土壤球菌属(Agrococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和红球菌属(Rhodococcus)。其中有10株细菌表现出不同程度耐金属离子Pb2+，Cu2+，Hg2+，Zn2+特性，占总检测菌株的83.33%。特别是L2，L6，L7，L8这4株细菌耐金属离子特性较高，占总检测菌株的33.33%。

铅锌尾矿； 细菌； 鉴定； 金属离子耐受性

在铅锌矿工业生产中总是伴随着一系列的环境问题，由于尾矿中常含有重金属离子及部分放射性物质，所以会导致重金属残留、空气污染、水污染等，这对尾矿周边的环境有较高程度的影响[1-3]。目前，国内外对重金属污染治理大致有3种主要措施，分别为：工程治理、化学治理及生物治理[4]。其中生物治理及修复主要表现为植物、微生物以及植物与微生物相结合的环境修复[5]。细菌对极端环境的适应能力较强，是土壤中金属离子成分调节的重要影响因子，对尾矿及周边地区的生物修复和对土壤生态环境的调节起到了至关重要的作用。

近年来，关于土壤和环境生物修复及重金属的富集等方面的研究，已转向尾矿附近微生物的分离，如对铜矿、铁矿、铀矿等，通过研究这类微生物的生物特性，寻找改变尾矿污染和恢复尾矿自然环境的方法。陕西宁强有着特殊的地理位置及丰富的自然矿产资源，研究其尾矿土壤中细菌的分布情况，在资源保护及环境治理方面更是有着重要的意义。陕西省汉中市宁强县燕子砭铅锌尾矿土壤细菌及其耐受性的研究尚未有报道，针对其尾矿中细菌及金属离子耐受性进行研究，旨在为铅锌矿区尾矿周边土壤的细菌分布、极端环境微生物资源及环境修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试土样

取自陕西省汉中市宁强县燕子砭(N32°54′43.10″E105°56′15.11″)铅锌尾矿土壤，在去除表面5 cm浮土后，通过五点取样法进行采样，将所取土样混合作为供试土样。

1.1.2 培养基

(1)LB培养基：蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂18.0 g，H2O 1000.0 mL，pH 7.4；

(2)牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15.0 g，H2O 1000.0 mL，pH 7.2；

(3)MM培养基：胰蛋白胨5.0 g，牛肉膏1.5 g，酵母浸粉 5.0 g，K2HPO43.0 g，KNO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，H2O 1000.0 mL，pH 7.3[6]。

1.1.3 仪器及设备

立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂)、超净工作台(SW-CJ-2F，苏净集团苏州净化设备有限公司)、生化培养箱(XPX-250BSH-Ⅱ，上海新苗医疗器械制造有限公司)、小型台式高速冷冻离心机(型号5424，德国Eppendorf)、PCR仪(型号TC-4000，英国TECHNE公司)和快速核酸提取仪(FastPrep-245G美国MP Biomedicals公司)等。

1.2 方 法

1.2.1 样品的处理及菌株的分离与纯化

(1)样品的处理 将风干的尾矿土壤样品用研钵磨碎，过筛后取1.0 g土样溶于9.0 mL无菌水中，涡旋仪涡旋5 min，取上清液作为10-1菌悬液，并梯度稀释至10-3备用[7-8]。

(2)菌株的分离与纯化 选择LB和牛肉膏蛋白胨培养基加入浓度为50.0 mg/L制霉菌素作为抑菌剂[9-11]。采用涂布平板法和平板划线法分离并纯化菌株。

1.2.2 菌株的初步鉴定

(1)形态学鉴定 利用显微镜及单染色技术进行形态学观察，从而获得细菌的显微形态特征，结合伯杰细菌手册对菌株进行描述。

(2)分子生物学检测 取菌体置于高频振荡管中，加入500.0 μL TE缓冲液和500.0 μL 氯仿∶异戊醇(24∶1)，置于DNA快速提取仪中振荡1min，速度6.0m/s，颠倒混匀10s，12 000r/min离心2min，上清液即作PCR模板，采用1%琼脂糖凝胶电泳进行DNA检测[12-13]。

①PCR扩增及检测分析 反应组分及用量(50.0μL体系)：MIX，25.0μL；引物27F，1.0μL；引物1492R，1.0μL；DNA模版，2.0μL；ddH2O，21.0μL。

②PCR反应引物 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

③PCR扩增程序 94 ℃，5min; 94 ℃，1min，56 ℃，1min，72 ℃，90s，33 个循环; 72 ℃，10min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，并送至上海生工检测序列[14]。

构建系统发育树：将菌株的16SrRNA基因序列提交至NCBI进行BLAST比对并索取登录号，选取相似度较高的菌株作为参考菌株，使用Mega5.0进行序列校准，按照近邻结合(Neighbor-Joining)聚类，选择1000个重复作Bootstrap值进行分析构建系统发育树。

1.2.3 金属离子耐受性评价

选择Pb2+，Cu2+，Hg2+，Zn2+4种常见金属离子，设置各金属离子浓度梯度，进行耐受性评价[6]。金属离子浓度如表1所示。

表1 各金属离子浓度梯度

注： 配制相应质量浓度的Pb(NO3)2，Cu(NO3)2，Hg(NO3)2，Zn(NO3)2母液，加入至MM固体培养基，进行菌株

金属离子耐受性实验。

美国幼儿身体活动的环境政策中强调以外部环境的吸引力激发幼儿积极主动地进行身体活动或参加体育运动。为幼儿提供身体活动的机会是幼儿主动参与活动的前提；稳定、便利的环境是幼儿身体活动的基础；限制幼儿久坐不动行为是增加幼儿身体活动的一种有效途径；教师或保育员的行为对促进或抑制幼儿身体活动有着重要影响；体育培训与教育对于增加家长与幼儿进行身体活动具有重要意义。综上可知，美国环境政策从不同方面促进幼儿身体活动，对幼儿身体活动的政策指导已经发展到比较细致的方面。

2 结果与分析

2.1 铅锌矿区尾矿中细菌的分离

从陕西宁强燕子砭铅锌尾矿土壤中共分离得到19株细菌，经比较排重，最终获得12株细菌。

2.2 铅锌矿区尾矿中细菌的初步鉴定

2.2.1 形态学特征

分离纯化出的12株细菌的形态学特征如表2所示。

表2 分离纯化的尾矿细菌形态学特征

表2结果表明，L1，L3等8株菌株显微结构呈杆状，约占总分离菌株的66.67%；L2，L6等4株菌株显微结构呈球状，约占总分离菌株的33.33%。L1，L5，L10，L12共4株菌呈油状，约占所分离菌株的33.33%；L2，L4，L6，L8共4株菌呈乳状，约占总分离菌株的33.33%；菌株L3呈粉状，约占总分离菌株的8.33%；L7，L9，L11共3株菌呈膏状，约占所分离菌株的25.00%。

(1)PCR结果分析

通过1%琼脂糖凝胶电泳检测16S rRNA，结果如图1所示。

图1 铅锌尾矿中细菌16S rRNA电泳检测结果

图1表明，陕西宁强铅锌矿区尾矿中分离得到的12株细菌经提取16S rRNA后的PCR扩增产物大小均在1500 bp左右，且较为一致，将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，双向测通后将序列拼接获得16S rRNA完整序列信息。

(2)系统发育树的构建

将测序结果提交至NCBI进行BLAST比对并索取登录号，根据BLAST结果，选择同源性较高的21株细菌的16S rRNA序列，利用MEGA5.0通过最大似然值法和进化距离阵法等进行近邻结合(Neighbor-Joining)聚类，1000个重复作Bootstrap值分析构建系统发育树。结果如图2所示。

注： 树枝上的数值为验证可信度，图左下端标尺表示碱基置换频率，且所有菌株已提交NCBI数据库并已获得登录号。图2 系统发育树

图2结果表明，菌株L2、L4、L8、L9和L12相应与松鼠葡萄球菌、芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、地衣芽孢杆菌及红球菌形成一个分支，验证可信度均达到100%；采用另外两种不同的建树方法(进化距离阵法及最大似然值法)所构建的系统发育树也证实此分支与邻位相算法分支完全吻合。L5菌株单独分为一支，但与假单胞菌等同源性达100%。陕西宁强铅锌尾矿中分离出的12株细菌主要分属：葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、土壤球菌属(Agrococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和红球菌属(Rhodococcus)。

2.3 铅锌矿区尾矿中细菌耐金属离子的生长

用平板划线法进行金属离子耐受性研究，37 ℃，培养48 h，结果如表3所示。

表3 细菌在不同金属离子浓度下的生长情况

注： 12株细菌中只有10株菌显示出金属离子耐受性，且每组实验中有5个平行对照；++++表示长势很好；

+++表示长势较好；++表示长势较弱；+表示长势很弱；-表示未长出。

表3结果表明，所得细菌中共10个菌株耐Pb2+特性较强，其中L1，L2，L4，L7，L8，L10，L11，L12共8个菌株耐Pb2+特性非常显著，均达到了2200.0 mg·L-1以上；L2，L6，L7，L8，L12共5个菌株耐Cu2+特性较强，其中L7，L8共2个菌株耐Cu2+特性非常显著，均达到了600.0 mg·L-1以上；L2，L6，L8，L9，L11，L12共6个菌株耐Hg2+特性较强，其中L6，L8共2个菌株耐Hg2+特性较显著，均达到了240.0 mg·L-1以上；L1，L2，L4等共10个菌株耐Zn2+特性较强，其中L2，L7，L8共3个株菌耐Zn2+特性非常显著，均达到了1200.0 mg·L-1以上；所分离出的L2，L6，L7，L8共4株细菌具有较高程度的耐Pb2+，Cu2+，Hg2+，Zn2+特性。

3 讨 论

对陕西宁强燕子砭铅锌尾矿土壤中细菌进行了分离、筛选及纯化，经比较排重后，共分离纯化出12株细菌。通过菌落形态观察、16S rRNA测序等方法进行研究，将序列提交至NCBI进行BLAST比对，根据结果构建系统发育树，所得细菌分属葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、土壤球菌属(Agrococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和红球菌属(Rhodococcus)等5个属。获得了在金属离子耐受性方面表现非常突出的高耐受重金属离子菌株，这对陕西宁强燕子砭铅锌矿区极端环境微生物资源的开发与利用具有一定指导意义。

朱静等人的研究表明，耐金属离子的细菌对Pb2+的最大耐受性可达2100.0 mg·L-1，对Zn2+的最大耐受性可达1200.0 mg·L-1，对Hg2+的最大耐受性可达500.0 mg·L-1，对Cu2+的最大耐受性可达450.0 mg·L-1[6,15-17]。本研究分离纯化得到12株细菌，其中有10株细菌表现出不同程度的耐Pb2+，Cu2+，Hg2+，Zn2+金属离子特性，占总检测菌株的83.33%，且菌株耐受性表现为Pb2+>Zn2+>Cu2+>Hg2+。L2，L6，L7，L8共4株细菌表现出较高程度的耐金属离子(Pb2+，Cu2+，Zn2+)特性，其中L2和L8属葡萄球菌属(Staphylococcus)，L6属土壤球菌属(Agrococcus)，L7属芽孢杆菌属(Bacillus)，均达到了耐Pb2+2200.0 mg·L-1, Cu2+600.0 mg·L-1, Zn2+1200.0 mg·L-1以上，占总检测菌株的33.33%，显现出对铅锌尾矿污染环境很好的生物修复潜力，可对寻找高耐受金属离子菌株、环境治理、极端环境微生物资源及生物修复等提供理论依据。

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[责任编辑：李 莉]

Isolation, identification and evaluation of metal ion tolerance of bacteria from lead-zinc tailings in Ning-qiang of Shaanxi

LUO Qiang1, XIE Xiu-chao1,2, CHEN Wen-qiang1,2, DENG Bai-wan1,2, PENG Hao1,2, JIANG Wu-chun1, TIAN Yue-xin1

(1.School of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China; 2.Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China)

The bacteria in the soil near the Shaanxi Ning-qiang lead-zinc tailings were isolated, and the heavy metal ion tolerance of the bacteria near the lead-zinc tailings lead was studie. This study aims to provide theoretical basis for the research of microbial resources in the lead zinc tailings contaminated areas. The bacteria were isolated and purified by dilution coating plate method. The 16S rRNA sequences were amplified and calibrated, and phylogenetic trees were constructed. The tolerance of the four kinds of metal ions (Pb2+, Cu2+, Hg2+, Zn2+) were studied. The results show 12 strains of bacteria were isolated and purified from the tailings soil, after the microstructural and morphological observation, combining with the phylogenetic tree constructed by sequencing of 16S rRNA. These bacteria are found inStaphylococcus,Pseudomonas,Agrococcus,BacillusandRhodococcus. In the aspect of metal ion tolerance, 10 strains of bacteria show different degrees of resistance to metal ions Pb2+, Cu2+, Hg2+and Zn2+, accounting for 83.33% of the total detected strains. Especially L2, L6, L7, L8 of the 4 strains of bacteria, tolerance characteristics of metal ions is higher, accounting for 33.33% of the total detected strains.

lead-zinc tailings； bacteria； identification； metal ion tolerance

2096-3998(2017)04-0075-06

2017-04-29

2017-05-27

陕西理工大学研究生创新基金资助项目(SLGYCX1620)

罗强(1992—)，男，陕西省西安市人，陕西理工大学硕士研究生，主要研究方向为微生物资源保育及开发；[通信作者]解修超(1978—)，男，山东省临沭县人，陕西理工大学副教授，硕士生导师，博士，主要研究方向为微生物代谢产物活性物质。

Q938

A