石墨烯增敏莱克多巴胺分子印迹电化学传感器

连惠婷， 杨 柳， 刘 静

(华侨大学 材料科学与工程学院， 福建 厦门 361021)

石墨烯增敏莱克多巴胺分子印迹电化学传感器

连惠婷， 杨 柳， 刘 静

(华侨大学 材料科学与工程学院， 福建 厦门 361021)

采用两步修饰的方式，先通过恒电位还原，将易分散于水的氧化石墨烯还原至玻碳电极表面形成均匀的还原氧化石墨烯修饰膜，再以吡咯为功能单体，采用电化学原位印迹技术制备了以莱克多巴胺(RAC)为模板分子的分子印迹聚合物膜，由此构建了用于莱克多巴胺的选择性灵敏测定的电化学印迹传感器。实验结果发现，在优化条件下，RAC的DPV响应电流在浓度为1.0×10-7～7.0×10-6mol/L范围内呈现良好的线性关系，且传感器对RAC具有良好的重现性(RSD=1.9%，n=7)。在印迹前修饰rGO，使印迹膜传感器对RAC的亲和力增强，响应速度提高，吸附量增加4.32倍，且其印迹因子IF=2.36，反映了良好的印迹效果及增敏效应。

莱克多巴胺； 分子印迹膜传感器； 还原氧化石墨烯

莱克多巴胺(C18H23NO3Cl，ractopamine，RAC)是一种人工合成的克仑巴安β肾上腺受体激动剂，可用于治疗充血性心力衰竭症、肌肉萎缩症、支气管炎等疾病。但如果一次摄入量过大，会出现头晕目眩、恶心呕吐、心跳加快、肌肉振颤等中毒现象，严重者甚至导致死亡，对人类健康有着极大的危害。将其添加到动物饲料中，可以实现“营养再分配”的效应，显著提高肌体的瘦肉率[1-2]。与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇等同属于“瘦肉精”类物质，均为β肾上腺素受体激动剂。而莱克多巴胺更容易在动物组织或者内脏中残留，其脏器残留量甚至比血液高20～90倍，当其通过食物进入人体时，会对肝脏、肾脏等内脏器官产生毒害[3-4]。我国自2011年12月5日起禁止生产和销售莱克多巴胺，禁止在畜产品生产中使用。对莱克多巴胺的分析检测也随之成为食品安全关注的热点之一，目前文献报道的莱克多巴胺的检测方法主要有免疫传感器法[5-7]、高效液相色谱法[8-9]和毛细管区带电泳法等[10-11]。因每个莱克多巴胺分子结构中包括有两个苯环、三个羟基和一个氨基，双酚羟基具有电活性，因此响应速度快。简便实用的电化学传感器也是莱克多巴胺的主要检测方法[12-15]。但生物样品内共存物较多，干扰较为严重，构筑对目标分子具有特异识别性的分子印迹膜作为电化学传感器的识别元件，是在复杂环境中准确测定莱克多巴胺的有效方法[16-18]，石墨烯的二维平面结构、大的比表面积和优良的电子传导速率使其被广泛用于改善电化学传感器的响应特性[19-25]。

基于此，本文结合印迹的预定制功能和石墨烯的增敏效应，为莱克多巴胺的准确定值构建一种基于聚吡咯印迹膜的电化学传感器。并借助扫描电镜、拉曼光谱、X射线衍射和电化学表征，以此探讨传感器的形貌组成和性能。同时也研究该传感器对莱克多巴胺的动力学和热力学吸附曲线，以此推测其对莱克多巴胺的电化学响应机制。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

(1)仪器：CHI660D型电化学工作站(上海辰华仪器公司)；SU70场发射扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)；Renishaw in Via显微拉曼光谱仪(英国Renishaw公司)，实验采用三电极体系，工作电极为玻碳电极(Φ=3 mm)及其修饰电极，辅助电极为铂丝电极，参比电极为银/氯化银电极(Ag/AgCl)。

(2)试剂：吡咯(Py，99%，Acros Organics)，莱克多巴胺(RAC，百灵威科技有限公司)，氧化石墨烯纳米片(GO，南京先丰纳米科技有限公司)，黄嘌呤(XA，沃凯化学试剂有限公司)、次黄嘌呤(HXA)、尿酸(UA)、抗坏血酸(AA)、鸟嘌呤(Gua)、肌酐(Cr)(国药集团化学试剂有限公司)，多巴胺(DA，分析纯，比利时Acros Organics公司)，铁氰化钾和亚铁氰化钾(上海国药集团化学试剂有限公司)。实验中所用水均为Milli-Q系统提供的超纯水(美国Millipore公司，18 MΩ/cm)，不同pH值的磷酸缓冲液(PBS)是由磷酸二氢钠、磷酸氢二钠按比例配置而成。

1.2 吡咯-莱克多巴胺聚合液配制

将一定量的RAC溶液加入到Py和KCl溶液中，在氮气氛围下磁力搅拌5 min配制成含Py(0.02 mol/L)+RAC(0.003 mol/L)+KCl(0.1 mol/L)的电聚合液，并于4 ℃避光保存，备用。

1.3 还原氧化石墨烯电化学微传感器的制备

用0.05 μm的氧化铝泥浆将玻碳电极(GCE)打磨至光滑的镜面，再分别于无水乙醇和二次蒸馏水中超声洗涤2 min，晾干后如图1构建还原石墨烯印迹膜传感器。通过电化学还原的方法在GCE上形成还原氧化石墨烯(rGO/GCE)[23]，即GO在醋酸缓冲液(0.1 mol/L，pH=5.0)中超声分散5 h，得到浓度为1.0 mg/mL的氧化石墨烯均相分散液；再在-1.6～0.5 V电位范围内以10 mV/s的循环伏安法(CV)将分散液中的氧化石墨烯电还原于GCE表面；然后取出电极以超纯水充分淋洗，晾干后即制得修饰电极rGO/GCE。再将rGO/GCE置于吡咯/莱克多巴胺聚合液中，在0.0～1.2 V电位范围内以50 mV/s的循环伏安法扫描10圈。取出，用超纯水淋洗后晾干，制得聚吡咯-莱克多巴胺聚合膜修饰电极(RAC-PPy/rGO/GCE)，最后将其置于甲醇和乙酸混合液(V甲醇︰V乙酸=4︰1)中，磁力搅拌洗脱RAC 6 min，再以超纯水充分淋洗，即制得留有与RAC空间构型互补空穴的印迹膜电极(MIPs/rGO/GCE)。

图1 还原氧化石墨烯-莱克多巴胺分子印迹膜的制备及识别过程

还原氧化石墨烯-莱克多巴胺非印迹电极(NIPs/rGO/GCE)的制备：除不含模板分子外，其他均与MIPs/rGO/GCE的制备过程相同。

1.4 实验方法

1.4.1 电化学方法

室温条件下，0.1 mol/L pH=6.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为莱克多巴胺的测定底液，利用微分脉冲伏安法(DPV)于0.20～1.00 V电位范围内扫描考察电化学传感器的性能，扫描前先在0.2 V的电位下搅拌富集6 min。微分脉冲伏安法的扫描速率为0.006 V，脉冲振幅为0.05 V，脉冲宽度为0.05 s。

电化学交流阻抗谱(EIS)实验和循环伏安法(CV)表征电极的修饰过程，以0.1 mol/L KCl溶液中的0.005 mol/L [Fe(CN)6]3-/4-为指示探针。其中EIS的频率范围为10～100 mHz，CV的扫速为50 mV/s。

本文中的实验数据都是运用CHI660D中自动扣除基线的软件处理得到的，电化学实验的电位都相对于Ag/AgCl参比电极，所有实验在室温(25±2) ℃下完成。

1.4.2 扫描电镜和拉曼光谱表征

利用SU70热场发射扫描电子显微镜(FESEM)和Renishaw in Via显微拉曼光谱仪表征ITO电极表面及其修饰膜的形貌特征及组成。

扫描电子显微镜的工作条件：样品需经过高温真空干燥和表面喷金处理，加速电压5.0 kV。拉曼光谱扫描参数：激光波长532 nm，扫描范围500～3200 cm-1，激光强度1%，曝光时间10 s，目镜倍数为50倍。

2 结果与讨论

2.1 印迹传感器的修饰膜表征

2.1.1 扫描电子显微镜(SEM)形貌分析

如图2(a)所示，ITO电极表面呈现平整均匀的致密结构；当表面通过电化学还原的方法修饰了rGO后，如图2(b)，其表面可观察到明显的石墨烯片层结构；图2(c)是在ITO表面利用印迹过程得到的颗粒状疏松多孔结构的莱克多巴胺分子印迹聚合膜(MIPs)，可能有利于物质在界面的转移；图2(d)则显示了在rGO层上的印迹聚合物(rGO/MIPs)的颗粒状致密多孔膜结构。对比图2(c)和图2(d)可知，rGO层上的颗粒较均匀，空间立体结构更明显。

图2 ITO电极表面不同修饰膜的SEM图

2.1.2 拉曼光谱表征

图3中的曲线A、B分别为GO和rGO膜的拉曼光谱图。从图中可以观察到在1340 cm-1和1600 cm-1处均有两个明显的特征谱带，分别对应于石墨烯上无序的sp3杂化碳和有序的sp2杂化碳原子特征谱带，即D带和G带。曲线B较之曲线A，其特征谱带有微小的负移，且D带和G带的峰值比增加，意味着sp2平均尺寸降低，这与前人的研究结果[23]相符。说明氧化石墨烯可通过电化学还原形成还原氧化石墨烯修饰膜。

2.1.3 X-射线衍射分析

图4中采用了X射线衍射分析法(XRD)来分辨玻碳电极表面电沉积不同修饰膜后的结构变化。图中的谱线A为修饰了氧化石墨烯(GO)的电极表面的XRD图谱，在9.2°出现(001)面强衍射峰，且未出现其他衍射峰。当氧化石墨烯通过电化学还原沉积于电极表面后，衍射图谱中同时出现9.18°(001)面的强衍射峰和24.02°左右的广角弥散衍射峰(谱线B)，表明部分氧化石墨烯(GO)在电沉积过程中和结构相对紊乱的还原氧化石墨烯(rGO)共沉积于电极表面，同文献[23]报道相吻合。谱线C为聚吡咯的XRD衍射图谱，其衍射曲线较为平滑，在22.3°可见微弱的衍射峰，结合文献[24]报道可知，无定形的非晶态结构聚吡咯已沉积于电极表面。谱线D上同时出现了22°聚吡咯衍射峰和25°左右的弥散还原氧化石墨烯衍射峰，表明PPy和rGO已经同时电沉积于玻碳电极表面。还原氧化石墨烯的结晶峰从24.02°位移到25°，且峰强度有所变大，推测是因为在吡咯与还原氧化石墨烯作用共聚合至电极表面的过程中的相互作用，促进了还原氧化石墨烯的结晶。

图3 GO和rGO的拉曼光谱图 图4 不同修饰膜的XRD图

2.2 印迹传感器的电化学响应特性

2.2.1 不同修饰膜传感器的伏安响应

图5(a)为GCE(曲线A)和RAC-PPy/GCE(曲线B)在空白PBS中的DPV曲线。相对于曲线A，在曲线B上可以观察到在0.60 V处有一氧化峰，这应该是RAC-PPy中的RAC的氧化峰，与插图中GCE在含模板分子8.0×10-7mol/L RAC的PBS中的DPV响应峰电位一致，说明曲线B上的氧化峰确实源于电极表面修饰膜中的RAC。

图5(b)则是曲线A、B、C、D分别对应于NIPs/rGO/GCE、rGO/GCE、MIPs/GCE、MIPs/rGO/GCE对1.0 ×10-6mol/L RAC的DPV响应。曲线D相对于曲线B和C，0.65 V处的RAC氧化峰电流显著增大，说明还原氧化石墨烯对RAC的氧化起增敏作用；曲线B、C的峰电流大于曲线A，表明石墨烯的增敏作用主要是因为其存在使印迹位点增加，从而提高了对RAC的检测灵敏度。

(a) 不含RAC (b) 含1.0×10-6 mol/L RAC图5 不同电极在PBS中DPV响应

2.2.2 传感器的交流阻抗谱

图6中的曲线A、B、C、D分别是GCE、rGO/GCE、MIPs/rGO/GCE、RAC-PPy/rGO/GCE的交流阻抗谱(EIS)，内插图为曲线A(GCE)和B(rGO/GCE)的放大。EIS曲线的半圆反映界面电子传递阻力Ret，半圆直径越大，Ret越大。由图可见，Ret-B

2.3 印迹传感器的特异识别性

注：内插图为A,B放大图6 不同修饰电极的电化学阻抗谱

图7 MIPs/rGO/GCE对莱克多巴胺及其结构相似物的响应

图8 不同膜传感器的吸附等温曲线

衡量印迹传感器的最重要的指标是选择性。我们测试了不同浓度的莱克多巴胺RAC及其结构相似物沙丁胺醇(Sal)、多巴(Dopa)、克伦特罗(Cle)以及黄嘌呤(XA)在MIPs/rGO/GCE上的响应情况。如图7所示，MIPs/rGO/GCE对莱克多巴胺的响应信号最大，且随着浓度的增加氧化峰电流也有明显的增加，由于克伦特罗(Cle)、沙丁胺醇(Sal)与莱克多巴胺结构相似度较高，导致该传感器对其也有微弱的响应。而对于黄嘌呤(Xan)和多巴(Dopa)由于其构型和莱克多巴胺的相似度较低，较难与印迹位点结合，所以MIPs传感器对其响应信号很小。由此可见，该印迹膜传感器对RAC的具有明显特异性识别，展示了较好的选择性和灵敏度。

2.4 印迹传感器的等温吸附特性

图8为构建的MIPs/rGO膜传感器(曲线A)与NIPs/rGO膜传感器(曲线B)对RAC在0～1.0×10-5mol/L浓度范围内的等温吸附曲线。可以看出曲线A响应电流随浓度的变化率远大于曲线B，且达到平衡的电流值也较高，说明RAC在印迹膜传感器上的响应明显灵敏于非印迹传感器上的。

若将等温吸附曲线按如下Langmuir方程式进行拟合：

其中c为吸附平衡时RAC的浓度(×10-6mol/L)；Kd为解离常数(×10-6mol/L)；Ip为RAC的氧化峰电流响应值(μA)；Ipm为RAC的最大响应电流(μA)。拟合参数如表1所示。Kd可以反映解离的快慢，其值越小说明解离的速度越慢，说明膜与RAC具有更强的亲和力。表1中Kd值A

印迹传感器的特异识别性也可通过印迹因子(IF)的大小来衡量，即比较模板分子在印迹膜与对应的非印迹膜传感器上的响应信号来实现，IF值越大表明印迹效果越好，对模板分子的特异性识别越强。

结合表1的数据计算，得出MIPs/rGO的最大吸附量是MIPs的4.32倍，而NIPs/rGO的最大吸附量是NIPs的12.6倍，MIPs/rGO的IF=2.36相对于MIPs的IF=7下降。说明还原氧化石墨烯的加入既增加印迹位点数，使其对RAC的特异性结合增多，同时也大大增加了非特异性吸附，因此其吸附量相对于NIPs/rGO虽增大明显，但IF反而下降。

表1 膜传感器对RAC的吸附等温曲线参数

2.5 印迹膜传感器的工作曲线及稳定性

在优化条件下，考察印迹膜传感器对不同浓度RAC的微分脉冲伏安响应。如图9所示，RAC的氧化峰电流与浓度在1.0×10-7～7.0×10-6mol/L范围内呈现良好的线性关系，其线性回归方程为Ip(μA)=0.016 15c(×10-6mol/L)+0.009 34(R2=0.9774)。

注：内插图为其拟合的线性工作曲线 图9 印迹膜传感器对不同浓度的RAC的DPV响应

实验同时考察了印迹膜传感器的稳定性。结果发现，对1.0×10-6mol/L的RAC连续测定7次，所得的氧化峰峰电流的相对标准偏差为1.9%；不同基体电极上构建的印迹膜传感器在相同条件下对RAC的响应峰电流的相对标准偏差为2.2%(n=3)，说明该方法具有较好的稳定性和重现性。

3 结 论

采用可控的电化学方法构筑了莱克多巴胺的石墨烯印迹膜电化学传感器。可溶性较好的氧化石墨烯的直接电还原和吡咯的原位聚合，极大简化了印迹膜传感器的构建过程，且该膜传感器对莱克多巴胺具有特异性识别。良好的选择性和重现性及较高的灵敏度使其对瘦肉精莱克多巴胺的监测既快捷又准确，具有良好的应用前景。

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[责任编辑：魏 强]

Sensitization of reduced grphene oxide to a molecular imprinting polymers based Electrochemical sensor for ractopamine

LIAN Hui-ting, YANG Liu, LIU Jing

(College of Materials Science and Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China)

In this paper, a molecular imprinting polymers and reduced grphene oxide (MIPs/rGO) based sensor was constructed for ractopamine by two steps operation on Glassy carbon Electrode(GCE). This MIPs was formed by using pyrrole as monomer and ractopamine as template molecular. Prior to that, reduced graphene oxide(rGO) was formed on GCE surface by electrochemical reducing the graphene oxide(GO) suspension. Based on the sensitizing effect of rGO and specific recognition of MIPs, the proposed sensor showed a satisfactory molecularly binding selectivity of RAC against its common structural analogues, and there was a linear response to RAC concentration range from 1.0×10-7mol/L to 7.0×10-6mol/L under the optimized conditions. Meanwhile, good stability(RSD=1.9%,n=7) was observed. Compared to NIPs/rGO based sensor, the MIPs/rGO based sensors have a stronger affinity to RAC with an imprinting factor(IF) of 2.36 and high absorption ratio of 4.32 that reflected the distinct synergistic effect of molecular imprinting and rGO.

ractopamine; molecular imprinting polymers based sensor; reduced graphene oxide

2096-3998(2017)04-0054-07

2017-03-15

2017-05-12

国家自然科学基金资助项目(21375049，21575044)；福建省自然科学基金计划项目(2013J01047，2015J01054，2016J01062)；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(JB-ZR1215)

连惠婷(1973—)，女，福建省惠安县人，华侨大学副教授，硕士生导师，主要研究方向为电化学传感器。

O657.1; TP212.2

A