公兔骶髓缺血损伤动物模型的建立及评估☆

赵树超董娴宁曲婷婷宋启民

·论 著·

公兔骶髓缺血损伤动物模型的建立及评估☆

赵树超*董娴宁*曲婷婷*宋启民△

目的建立公兔不同水平骶髓缺血损伤动物模型并应用球海绵体肌反射（bul bocavernosussphi nct er ref l ex,BCR）对模型进行评估。方法36只新西兰大白兔公兔随机区组法分为实验组（n=30）和对照组（n=6），实验组按照尾头方向结扎左肾动脉和动脉分叉间腰动脉的水平分为1根、2根、3根、4根和5根组共5亚组（n=6），分别结扎1根、2根、3根、4根和5根腰动脉，记录血管结扎后2 h及2 d的BCR波，分别在麻醉清醒和血管结扎后2 d进行运动功能评分，2 d后取骶髓H E切片观察。对照组（n=6）用于排除麻醉、手术对BCR的影响。结果对照组麻醉和手术后不同时间的波幅应用单组重复测量数据的方差分析，差异均无统计学意义（F=1.234和F=1.492，均P＞0.05）；对照组麻醉和手术后不同时间的潜伏期应用单组重复测量数据的方差分析，差异均无统计学意义（F=0.911和F=3.80，均P＞0.05）。实验组术前、结扎后2 h和结扎后2 d三个时间点BCR波幅与基线波幅的百分比值，经单因素重复测量数据的方差分析差异有统计学意义（F=1029.943,P＜0.05）；实验组术前、结扎后2h和结扎后2 d三个时间点BCR潜伏期，经单因素重复测量数据的方差分析，结果差异有统计学意义（F=22.711,P＜0.05）。1根组、2根组手术前后和3根组术后2 d运动功能评分无变化；3根组麻醉清醒后和4根、5根组手术后不同时间运动功能评分与对照组和手术前经W i l coxon秩和检验均P＜0.05，差异均有统计学意义。结论通过尾头方向分别结扎左肾动脉和动脉分叉间不同水平的腰动脉可以建立不同程度的骶髓缺血损伤动物模型。

球海绵体肌反射 骶髓缺血损伤 动物模型 公兔

骶髓圆锥及马尾部的功能包括大小便功能及性功能，该部位损伤所致的大小便功能障碍及性功能障碍是一种严重的伤残。人类球海绵体肌反射（bulbocavernosus sphincter reflex,BCR）反映人第2到第4骶髓和骶段感觉和运动神经通路的完整性[1]，解剖研究表明兔骶髓圆锥及马尾的血液供应主要由左肾动脉和动脉分叉间的5条腰动脉及其分支供应[2-3]，本实验我们通过尾头方向依次结扎公兔左肾动脉和动脉分叉间的不同水平的腰动脉建立不同水平的公兔骶髓缺血动物模型，并应用BCR对该模型进行评估，为男性骶髓功能研究及保护提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象健康新西兰大白兔公兔36只，体质量3.0～3.5 kg。随机区组法分为实验组(n=30)和对照组(n=6)。实验组按照尾头方向结扎腰动脉的水平分为1根、2根、3根、4根和5根组共5亚组（n=6)，分别沿尾头方向顺序结扎左肾动脉与动脉分叉之间1根、2根、3根、4根和5根腰动脉，腰动脉结扎后记录血管结扎后2 h及血管结扎后2 d的BCR波。对照组(n=6)麻醉后的3 h内每30 min记录一组BCR连续刺激记录3 h以排除麻醉对BCR的影响。对照组(n=6)行手术操作分离出腰动脉而不结扎腰动脉，在手术前和手术后不同时间内记录BCR以排除手术对BCR的影响。实验组、对照组均在麻醉清醒后和血管结扎后2 d进行运动功能评分，2 d后取缺血区骶髓标本进行苏木素伊红（HE）染色，观察骶髓病理变化。

1.2 手术步骤[2]将实验兔3%戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉(l mL/kg)，实验过程中根据动物的反应，追加初始剂量的1/3～1/2，动物腹部、会阴部备皮，酒精擦洗消毒，将四肢固定于手术台上，腹部正中长约10 cm的纵行手术切口，腹腔的肠道小心翻向右侧，用温湿纱布包扎，以减少水分蒸发和热量散失，腹膜后区分离腹主动脉和下腔静脉，分离出左肾动脉和动脉分叉之间的所有5条腰动脉，如遇血管变异情况将该动物排除。实验过程中，空调开放保持室温在24～26℃，肛温维持不低于38℃，并根据术中出血量的多少静脉补充生理盐水，实验操作完毕后，缝合肌肉、皮肤。青霉素40万单位肌肉注射预防感染。

1.3 公兔BCR的刺激和记录方法[4]应用EPOCHX P神经电生理监测设备（Axon公司，美国），刺激电极阴极为刺激端，固定于兔阴茎背侧（近端），阳极为参考电极，固定于兔阴茎对侧（远端）。记录电极的安放：记录电极阴性端固定在左侧肛门括约肌，参考电极阳极固定在同侧肛门括约肌，其间距离约5 mm，刺激和记录电极中间接地。参数设置：刺激强度 1～10 mA；双脉冲自动刺激；刺激频率1Hz；刺激间期0.3 ms。记录参数：显示灵敏度100～1000 μV/div；时间基线5 ms/div；带通滤波范围1～4000 hz；每次平均化处理10个信号，信号分析时间50 ms；陷波滤波器50 Hz关闭。

1.4 Tarl ov下肢运动功能评分标准[5]0分:后肢无运动不能负重；1分:后肢可见活动，但不能负重;2分:后肢活动频繁或有力，不能负重;3分:后肢可支持体重，可行走1～2步;4分:可行走仅有轻度障碍;5分:行走正常。

1.5 统计学分析采用 SPSS17.0进行统计学分析，计量资料用±s表示，实验组结扎前后比较采用配对t检验，各组手术前后不同时间点比较重复测量方差分析；等级资料比较采用秩和检验；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 动物模型建立及BCR典型波形在实验过程中，3只兔子因腰动脉的变异或术中大出血被排除，其余兔均顺利通过手术及术后评估过程，麻醉清醒后，自由进食，模型成功率91.7%%,BCR典型的波形为二相波或三相波，见图1。

图1 典型的公兔BCR波形。“Lat”为潜伏期指从刺激开始到出现波形；“N1”为第一个向上的负向波；“P1”为第一个向下的正向波；“N1-P1”为波幅，红色为扎前的基线波形，绿线为结扎后的波形

图2 麻醉后不同时间记录的BCR波

2.2 对照组对照组麻醉后不同时间的波幅应用单组重复测量数据的方差分析，球形检验结果χ2= 30.285,P＜0.05，数据不符合Huynh-Feldt条件，不满足球形假设，采用校正后的方差分析结果差异无统计学意义（F=1.234,P＞0.05）；对照组麻醉后不同时间的潜伏期应用单组重复测量数据的方差分析，球形检验结果χ2=22.582,P＞0.05，数据满足球形假设，结果差异无统计学意义 （F=0.911,P＞0.05），见图2。对照组手术前后不同时间的波幅应用单组重复测量数据的方差分析，球形检验结果χ2=4.983，P＞0.05，数据满足球形假设，结果差异无统计学意义（F=1.492,P＞0.05）；对照组手术前后不同时间的潜伏期应用单组重复测量数据的方差分析，球形检验结果χ2=3.762，P＞0.05，数据满足球形假设，结果差异无统计学意义 （F=3.80,P＞0.05）。以上结果表明麻醉和手术均不会对实验结果造成影响。

2.3 实验组BCR波幅和潜伏期的变化实验组术前、结扎后2 h和结扎后2 d三个时间点BCR波幅与基线波幅的百分比值，经单因素重复测量数据的方差分析，球形检验结果χ2=2.454，P＞0.05，数据满足球形假设，结果差异有统计学意义 （F= 1029.943,P＜0.05），各实验组组间比较结果差异有统计学意义（F=238.337,P＜0.05）。实验组术前、结扎后2 h和结扎后2 d三个时间点BCR潜伏期，经单因素重复测量数据的方差分析，球形检验结果χ2=2.169，P＞0.05，数据满足球形假设，结果差异有统计学意义（F=22.711,P＜0.05），各实验组组间比较，结果差异有统计学意义（F=2.699,P＜0.05）；

1根组血管结扎后2 h和2 d的波幅与基线波幅的比值与结扎前经配对样本t检验均差异无统计学意义（t=0.441和t=0.204，均P＞0.05）；2根组血管结扎后2 h和2 d的波幅与基线波幅的比值与结扎前经配对样本t检验均差异有统计学意义（t=7.357和t=4.385，均P＜0.05）；3根组血管结扎后2 h和2 d的波幅与基线波幅的比值与结扎前经配对样本t检验均差异有统计学意义 （t= 9.113和t=15.109，均P＜0.05）；4根组血管结扎后2 h和2 d的波幅与基线波幅的比值与结扎前经配对样本t检验均差异有统计学意义（t=34.593和t=21.491，均P＜0.05）；5根组血管结扎后所有兔结扎后波形消失。1根组血管结扎后2 h和2 d的潜伏期与结扎前经配对样本t检验均差异无统计学意义（t=0.232和t=0.272，均P＞0.05）；2根组血管结扎后2 h和2 d的潜伏期与结扎前经配对样本t检验均差异有统计学意义（t=2.654和t=0.272，均P＜0.05）；3根组血管结扎后2 h和2 d的潜伏期与结扎前经配对样本t检验均差异有统计学意义（t=3.445和t=3.333，均P＜0.05）；4根组血管结扎后大部分兔波形消失；5根组血管结扎后所有兔结扎后波形消失，见图3～7，表1、2。

2.4 骶髓病理切片组织形态学观察对照组、1根组和2根组正常脊髓组织结构完整,神经细胞形态正常，见图8；3根组脊髓结构基本完整，见较多正常形态神经元，个别神经元体积缩小，胞质浓缩，核染色质密度增高，呈凋亡样变；5根组脊髓正常结构基本消失,大多数神经元细胞核萎缩或溶解,胞质呈嗜伊红染色,胞质中尼氏体消失，见图9；4根组介于3根组与5根组脊髓损伤之间。

表1 各组血管结扎前后不同时间点BCR波幅与基线波幅的比值 （n=6,±s）

表1 各组血管结扎前后不同时间点BCR波幅与基线波幅的比值 （n=6,±s）

1）经配对t检验，与结扎前比较，P＜0.05

组别1根组2根组3根组4根组5根组结扎后2 h 99.8%±2.5% 88.5%±3.8%1）31.5%±16.8%1）3.4%±6.8%1）0±0手术前100%±0% 100%±0% 100%±0% 100%±0% 100%±0%结扎后2 d 100.3%±3.5% 92.0%±4.5%1）28.0%±10.7%1）6.7%±10.6%1）0±0

表2 各组血管结扎前后不同时间点BCR潜伏期（n=6，ms,±s）

表2 各组血管结扎前后不同时间点BCR潜伏期（n=6，ms,±s）

1）经配对t检验，与结扎前比较，P＜0.05

组别1根组2根组3根组4根组5根组结扎后2 h 10.9±1.8 13.4±1.31）13.3±1.01）手术前11.0±1.8 12.7±1.3 11.9±1.3 12.6±1.6 11.9±1.8结扎后2 d 10.9±1.9 13.2±1.31）13.8±0.91）/ / / /

图3 1根组腰动脉结扎前后的BCR波。红色为扎前的基线波形，绿线为结扎后的波形

2.5 Tarlov下肢运动功能评分结果1根组、2根组麻醉清醒后、手术后2 d及3根组手术后2 d与对照组同时间运动功能评分采用两独立样本比较的Wilcoxon秩和检验比较均无统计学差异（均P＞0.05）；对照组、1根组、2根组麻醉清醒后、手术后2 d及3根组手术后2 d与手术前运动功能评分经配对样本Wilcoxon符号秩和检验比较均无统计学差异 （均P＞0.05）；3根组、4根组和5根组与对照组麻醉清醒后运动功能评分经两样本比较的Wilcoxon秩和检验，差异有统计学意义（Z=-3.028、Z=-3.127和Z=-3.162，均P＜0.05）；4根组和5根组与对照组手术后2d运动功能评分经两样本比较的Wilcoxon秩和检验，差异有统计学意义（Z=-2.271和Z=-3.071，均P＜0.05）；3根组、4根组和5根组麻醉清醒后与手术前运动功能评分经配对样本比较的Wilcoxon秩和检验，差异有统计学意义 （Z=-2.070，Z=-2.251和Z=-2.236，均P＜0.05），4根组和5根组手术后2 d与手术前运动功能评分经配对样本比较的Wilcoxon秩和检验，差异有统计学意义（Z=-2.271和Z=-2.121，均P＜0.05）,表3。

图4 2根组腰动脉结扎前后的BCR波。红色为扎前的基线波形，绿线为结扎后的波

图5 3根组腰动脉结扎前后的BCR波。红色为扎前的基线波形，绿线为结扎后的波形

图6 4根组腰动脉结扎前后的BCR波。红色为扎前的基线波形，绿线为结扎后的波形

图7 5根组腰动脉结扎前后的BCR波。红色为扎前的基线波形，绿线为结扎后的波形

图8 对照组骶髓H E切片（×200）。箭头所示：神经元细胞结构完整

图9 5根组骶髓H E切片（×200）。箭头所示：正常神经元细胞结构消失

表3 运动功能评分(分)M(QL,QU)

3 讨论

本实验主要应用BCR评估不同水平的公兔骶髓缺血损伤动物模型，男性BCR感觉传入神经通路由远端向近段传导，由阴茎背神经、阴部神经、骶神经丛,S2、S3和S4骶神经根构成[6]，BCR躯体运动传出通路由近端向远端传导，由骶髓神经元细胞，S2、S3和S4骶神经根，阴部神经，骶神经丛，阴部神经深支和球海绵体肌构成。BCR可以用于评估较低的骶部神经反射的完整性，它可以反映人第2到第4骶髓和骶段感觉和运动神经通路的完整性[7]。

男性骶髓圆锥及马尾部血管性、脊柱、脊神经病变或外伤都会造成该部位的骶神经功能障碍，引起大小便功能障碍或男性性功能障碍[8]，严重影响患者的生活质量，该部位疾病在临床治疗上的进步有赖于脊髓实验研究的发展，成功的实验研究又有赖于既能反映人类脊髓损伤的特点，又便于进行观察和施加处理因素的动物模型的建立[9]。Tator等认为脊髓继发性损伤最基本的机制是“血管机制”，即脊髓缺血缺氧在脊髓继发性损伤中具有重要作用，因此加深对脊髓缺血后脊髓灌注血管网相关的生理和功能反应的研究，特别是这个反应过程的时间变化特点[10]，可以帮助阐明怎样最好的预防脊髓缺血后神经功能障碍的发生，即使脊髓的重要的供血血管被阻断，也不过会发生脊髓功能障碍[11]。本实验沿尾头方向结扎公兔左肾动脉和动脉分叉间的腰动脉，结扎2根组、3根组4根组及5根组均见BCR波潜伏期延长及波幅降低，术后2d骶髓病理切片证实在3根组4根组及5根组见不同程度的脊髓缺血性损害。

总之，尾头方向分别结扎公兔左肾动脉和动脉分叉间不同水平的腰动脉可以建立不同程度的骶髓缺血损伤动物模型，该模型可用于对男性骶髓功能的研究。

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R744.1

A

2016-12-05）

（责任编辑：甘章平）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.07.009

☆山东医药卫生科技发展计划面上项目（编号：2015WS0375）

* 青岛大学附属医院病理科（青岛 266000）

△山东省临沂市人民医院神经外科