臭氧对大鼠星形胶质细胞作用的临床研究

刘涛+钱立全

[摘要] 目的 探究臭氧对大鼠星形胶质细胞的作用。 方法 选择2016年1—12月期间36只大鼠。均行体外培养及免疫细胞化学鉴定。依培养基所输气体的不同将其均分至A、B、C 3组。A组加入纯氧进行作用；B、C两组则分别加入400 μL的臭氧（O3）进行20 min的作用，其中B组所加臭氧规格为40 μg/mL，C组所加臭氧规格为80 μg/mL，对比3组不同培养基下大鼠星形胶质细胞的差异。结果 B组大鼠Ast的LDH漏出率在培养2 h时为（18.4±2.5）%，4 h时为（18.9±2.6）%，均优于A组（P<0.05）；而C组大鼠LDH漏出率在2、4 h时分别为：（30.7±5.6）%、（35.0±4.5）%，均明显高于A组（P<0.01）。结论 高浓度的臭氧在短时间内对大鼠的星形胶质细胞具有明显的损伤作用，而低浓度臭氧如40 μg/mL则无上述作用。

[关键词] 星形胶质细胞；体外培养；完全培养基；臭氧；作用

[中图分类号] R5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）06（b）-0044-03

[Abstract] Objective To study the effect of ozone on the astrocytes function of rats. Methods 36 rats in our hospital from January to December 2016 were selected and underwent the in vitro culture and immunocytochemical identification， and they were divided into the three groups according to different media gas， the group A adopted the pure oxygen for function， the group B and group C respectively adopted the 400 μL ozone for 20 min function， and the ozone specification in the group B and in the group C was respectively 40 μg/mL and 80 μg/mL， and the difference in the astrocytes between the three groups was compared. Results In the group B， the LDH leakage rate of rats Ast in the group B was （18.4±2.5）% at 2 h and （18.9±2.6）% at 4 h， which were better than those in the group A，（P<0.05）， and the LDH leakage rate in the group C was respectively （30.7±5.6）% and （35.0±4.5）% at 2 h and 4 h， which were obviously higher than those in the group A（P<0.01）. Conclusion The high-concentration ozone has an obvious injury effect on the astrocytes function of rats in a short time， but the low-concentration ozone such as 40ug/ml cant produce the same effect.

[Key words] Astrocytes； In vitro culture； Complete medium； Ozone； Function

隨着医疗技术的飞速发展，医用气体的不断进步，使得臭氧的应用也越发广泛。大量研究表明，浓度适宜的臭氧不仅能够有效抑制机体炎症反应、减少新生血管的生成，而且能够有效调节机体相关组织供氧、抑制相关应激反应。尤其是在脊柱源性腰腿痛以及脑缺血等病症方面具有显著疗效。但研究亦发现，对于长期接触的人群如印刷工人往往会因长期处于低浓度臭氧环境中而出现脑损伤等病症。随着对臭氧研究的不断深入，不少研究发现臭氧对于星形胶质细胞也具有一定的影响作用[1]。因此，该文就臭氧对2016年1—12月期间培养的大鼠星形胶质细胞的作用情况进行更进一步探究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

36只实验大鼠均取自该院实验中心，且均为1～2日龄SD乳大鼠。研究所用仪器及试剂有：E80医用臭氧发生器、Forma371型二氧化碳孵育箱、DMEM/F12培养基、乳酸脱氢酶试剂盒（LDH试剂盒）、胎牛血清（FCS）、鼠抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）以及台盼蓝和胰蛋白酶等。

1.2 方法

1.2.1 Ast的培养及特征鉴定 （1）对36只实验大鼠进行统一的Ast培养。一般现取乙醚对大鼠进行麻醉处理，麻醉后立即采用浓度为75%的乙醇进行全面的消毒，而后进行手术取脑操作，取脑后立即将大鼠的大脑皮质进行有效的分离，并用吸管进行吹气处理，直至大脑皮质成糊状停止吹气，而后使用胰蛋白酶进行消化处理，时间以10 min为宜。同时制备完全培养基，即取DMEM/F12为主，并添以10%的FCS进行终止消化，然后进行过滤、离心操作。孵育箱内相关参数设定为5%CO2+95%空气，温度37℃，湿度则应设置为饱和湿度，孵育时间以20 min为宜。孵育完成后立即将培养瓶翻转，并随即将细胞悬液吸出，进而有效去除悬液中成纤维细胞。翻转吸液操作应进行两次。在成纤维细胞去除完毕后，立即进行接入培养皿的接种操作，接种时细胞浓度应调为1.5×106/mL，并且需1～2 d将培养液进行换液1次，并倒置于显微镜下对Ast的形态情况及生长规律进行观察记录。培养以细胞铺满瓶底且胰蛋白酶消化传代培养培养到第3周后进行实验[2]。

（2）进行Ast的特征鉴定，即通过GFAP免疫细胞化学染色法进行特征的鉴定。③使用中性甲醛进行10～12 min的固定，而后使用过氧化酶进行阻断处理，时间以10 min为宜。②将鼠抗（一抗）-抗GFAP抗体置于温度为4℃的冰箱中过夜，而二抗则先放置于室温下10 min，链亲合素-过氧化酶溶液10 min，最后采用二氨基联苯胺进行显色。

1.2.2 臭氧干预实验 采用24孔培养板承接细胞传代，每孔承接细胞接种以7×105个细胞为宜，然后于第2天将细胞贴壁牢固，并依据干预所用气体的不同将其均分至A、B、C 3组。3组均采用Giuseppe所用方法，即利用“Y”形三通连接管，连接两注射器，分别自臭氧发生器、氧气袋内抽取臭氧或氧气，然后将气体快速推至含有相同体积、相同组分的完全培养基中（CM）的注射器内，并连续摇动，3组摇动作用时间均以20 min为宜。其中，A组加入纯氧进行作用（一般以400 μL的纯氧作用20 min）；B、C两组则分别加入400 μL的臭氧（O3）进行20 min的作用，其中B组所加臭氧规格为40 μg/mL，C组所加臭氧规格为80 μg/mL。作用完成后立即将3组细胞放回CO2孵育箱内，并分别于放回箱内的2 h和4 h收集其各自细胞上清液，并将细胞刮下后于冰浴中令其破碎。最后，进行LDH漏出率测定以及细胞死亡百分比的计算。其中，LDH漏出率的测定主要通过对两时间节点所取上清液和细胞匀浆液中二者吸光度值测定，一般采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测定，而后依照LDH漏出率公式进行计算。而细胞死亡百分比的测定则分别采用台盼蓝进行计数200个相邻细胞中染蓝、未染蓝细胞个数，进而计算死亡细胞百分比[2]。

1.3 统计方法

所有数据均采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，计量资料应用平均值±标准差（x±s）表示，计量资料组间比较采用独立样本t检验，计数资料以百分率（%）表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LDH漏出率差异

A组2 h与4 h漏出率大致相同，约为23%；而B组无论是2 h还是4 h其漏出率值均明显小于A组，组间对比差异有统计学意义（P<0.05），而组内其两节点对比则差异无统计学意义（P>0.05）。而C组无论是2 h还是4 h两节点漏出率值较之AB两组均明显升高（P<0.05），且組内对比4 h漏出率值也明显高于2 h的值，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 细胞死亡百分比差异

A组2 h和4 h死亡细胞百分比均约为11%，B组则在10%左右，两组相比差异无统计学意义（P>0.05）。而C组无论是2 h还是4 h其死亡细胞百分比均显著高于A、B两组，差异有统计学意义（P<0.05）。同时，组内对比C组4 h的死亡细胞百分比也明显大于2 h（P<0.05）。见表2。

3 讨论

作为人体脑神经细胞中占比最高的神经细胞之一，星形胶质细胞不仅具有营养神经元、支持神经元的作用，而且能够有效清除危害神经元的毒性氨基酸，进而有效保护神经元，令神经元正常发挥其应有作用。随着临床上对星形胶质细胞研究的不断深入，尤其是在这个中枢神经损伤频繁的大背景下，大量临床研究发现，诸如细胞因子、趋化因子等很多炎症介质均是由星形胶质细胞分泌而来，这些炎症介质的分泌有效的调节了神经元的各项功能，进而促进大脑中枢神经系统的正常工作[3]。

臭氧作为目前大气污染中常见的一种组分，不仅已有大量研究表明该气体对呼吸道具有明显的损伤作用，而且对于脑神经细胞尤其是星形胶质细胞也有一定的消极影响。但也有研究表明，适量的臭氧不仅不会损害人体细胞，而且有助于抑制炎症反应、调节组织缺氧的积极作用[4]。进一步研究表明，作为氧元素单质的一种，臭氧不仅理化性质不稳定，而且其氧化性极强，加之其作用靶分子为机体内的不饱和脂肪酸，因此，细胞膜是臭氧最易侵袭损害的部位。而细胞膜的受损又会导致细胞中LDH释放的增多，即漏出率增大。临床上也常常以细胞LDH的漏出率大小来判定细胞受损的具体情况[5]。同时，细胞膜受损将直接影响细胞膜的通透性，因此，采用台盼蓝等染色物质进入细胞染色，可通过染蓝（死亡细胞）与未染蓝（存活细胞）情况来判定细胞死亡情况，进而计算出细胞死亡百分比[6-7]。

该文就臭氧对大鼠星形胶质细胞的作用情况进行了更进一步探究，结果表明，B组大鼠Ast的LDH漏出率在培养2 h时为（18.4±2.5）%，4 h时为（18.9±2.6）%，均优于A组（P<0.05）；而C组大鼠LDH漏出率在2、4 h时分别为：（30.7±5.6）%、（35.0±4.5）%，均明显高于A组（P<0.01）。这与董力等[8]相似研究结果一致，其研究表明大鼠Ast的LDH漏出率在培养2 h时为（17.8±5.3）%，4 h时为（16.4±2.9）%，均与该文研究组结果相似。深入分析结果发现，对于实验大鼠Ast高浓度的臭氧的确具有明显的损伤作用。无论在LDH漏出率方面，还是死亡细胞百分比方面，高浓度的（80 μg/mL）臭氧的C组均明显高于纯氧的A组与低浓度臭氧的B组（40 μg/mL），差异有统计学意义（P<0.05）。即高浓度臭氧对于大鼠星形胶质细胞具有明显的损害作用。

综上所述，纯氧及低浓度臭氧对大鼠星形胶质细胞无消极影响，而高浓度臭氧则具有明显的损伤作用，对此临床上应予以高度重视。

[参考文献]

[1] 喻姗姗，刘远玲，陈曦，等.Sulfiredoxin-1对大鼠星形胶质细胞缺血损伤的保护作用[J].第三军医大学学报，2015，37（1）：11-15.

[2] 马霄，陈晓敏.针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠星形胶质细胞影响实验研究[J].医药， 2016（1）：176.

[3] 牛非，胡金风，苑玉和，等.星形胶质细胞在脑缺血中的变化和作用[J].中国药理学通报，2011，27（10）：1342-1345.

[4] 王全保，刘运涌，范新蕾，等.氟代柠檬酸对 SD 大鼠星形胶质细胞的抑制作用及相关机制[J].山东医学高等专科学校学报， 2016， 38（2）：135-138.

[5] 黄晓佳，李静，许潇，等.SDF-1α促进原代培养大鼠星形胶质细胞增殖的作用[J].中国药理学通报，2014，30（9）：1219-1224.

[6] 曲晨，鲁翔，何慧薇，等.甲基汞诱导大鼠皮层星形胶质细胞凋亡活性分析[J].药物分析杂志， 2015（7）：1153-1159.

[7] 孙树凯，马磊，张海红，等.Rap1a高表达对SNL大鼠神经病理性疼痛及星形胶质细胞自噬的影响[J].第三军医大学学报， 2016， 38（21）：2335-2339.

[8] 董力，顾雯，阳晓燕，等.不同形状纳米氧化铝对大鼠脑星形胶质细胞的细胞毒性[J].环境与健康杂志， 2016， 33（2）：95-99.

（收稿日期：2017-03-12）