大鼠肝纤维化组织中BMP—2的动态表达和意义

朱碧红+张慧芳+林镯+张磊+董培红+潘珍珍+陈永平

[摘要] 目的 探討大鼠肝纤维化组织中骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）的表达趋势及意义。 方法 用皮下注射四氯化碳构建大鼠肝纤维化模型，造模后4周、8周、12周分别检测血清层粘蛋白（LN）、透明质酸（HA）的变化，采用HE及Masson染色光学显微镜下观察肝组织损伤情况，采用Real-Time PCR、免疫组织化学和Western印迹检测各组大鼠肝组织中BMP-2的表达。采用单因素方差分析进行多组均数间的比较。 结果 肝纤维化模型组血清LN、HA明显升高。在对照组和肝纤维化模型组中BMP-2 mRNA均有表达。模型组4周时BMP-2 mRNA表达与对照组无显著差异（P>0.05），模型组8周、12周较对照组显著下降（P均<0.05）。与模型组4周相比，模型组BMP-2 mRNA的表达在8周、12周显著下降（P均<0.05），12周达最低。免疫组织化学证实，BMP-2在肝纤维化模型组较对照组大鼠肝组织中表达减少。在对照组和肝纤维化模型组中BMP-2蛋白均有表达。模型组4周时BMP-2蛋白表达与对照组无显著差异（P>0.05），模型组8周、12周较对照组显著下降（P均<0.05）。与模型组4周相比，模型组BMP-2蛋白的表达在8周、12周显著下降（P均<0.05），12周达最低。 结论 BMP-2在正常SD大鼠肝脏有表达，随着肝纤维化进展，表达减少，提示BMP-2参与肝纤维化的发生、发展过程。

[关键词] 骨形成蛋白2；肝纤维化；四氯化碳；大鼠

[中图分类号] R575.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）20-0032-04

[Abstract] Objective To explore the expression and significance of bone morphogenetic protein-2（BMP-2） in rats models of hepatic fibrosis. Methods SD rat models with hepatic fibrosis were established by injecting carbon tetrachloride（CCl4）. Serum laminin（LN） and hyaluronic acid（HA） levels were tested from hepatic fibrosis group at the time of 4 week， 8 week， 12 week. Pathological characters of liver tissue were observed under optical microscope after hematoxylin-eosin and Masson staining. And the expressions of BMP-2 were detected by the methods of Real-Time polymerase chain reaction（Real-Time PCR）， immunohistochemistry and Western blot in rat fibrosis tissues. Comparisons between groups were analyzed by one-way ANOVA. Results LN and HA in model group were significantly higher than those in control group. All of normal control group and hepatic fibrosis groups expressed BMP-2 mRNA. Compared with control group， the expression of BMP-2 mRNA of the model group at week 4 had no significant difference， but were significantly lower at week 8 to 12. Compared with model group at week 4， the expression of BMP-2 mRNA of the model group at week 8 to 12 decreased significantly， and reached the nadir at week 12. Immunohistochemistry proved that the expressions of BMP-2 in hepatic fibrosis groups were all significantly lower than control group. All of normal control group and hepatic fibrosis groups expressed BMP-2 protein. Compared with control group， the expression of BMP-2 protein of the model group at week 4 had no significant difference， but were significantly lower at week 8 to 12. Compared with model group at week 4， the expression of BMP-2 protein of the model group at week 8 to 12 decreased significantly， and reached the nadir at week 12. Conclusion BMP-2 expressed in the liver of normal SD rats， and decreased along with the progress of hepatic fibrosis. These indicated that BMP-2 might be involed in the pathogenesis and development of hepatic fibrosis.

[Key words] Bone morphogenetic protein-2； Hepatic fibrosis； Carbon tetrachloride； Rats

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是由各种致病因子（如肝炎病毒、乙醇、自身免疫、化学毒物或药物等）引起的肝脏损伤和炎症，导致细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过量沉积，是各种慢性肝病发展到肝硬化必经之阶段。骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）可影响多种细胞的增殖、分化和凋亡，参与组织的再生和修复，属于TGF-β超家族成员[1]。骨形成蛋白2（BMP-2）是其中研究最活跃的成员之一[2]，已知具有调控细胞生长、分化及骨质生成等功能，与肝纤维化的关系研究甚少。本研究通过观察BMP-2在大鼠肝纤维化模型中的动态表达，初步探讨BMP-2在肝纤维化进程中的可能作用，为进一步研究其作用机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1实验动物与试剂

清洁级24只健康雄性SD大鼠，体重（200±10）g，由上海剑钝生物科技有限公司提供。HE染色和Masson染色试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；放射免疫沉淀法（RIPA）组织细胞快速裂解液购自基尔顿生物科技（上海）有限公司；SYBR Green PCR试剂盒、逆转录试剂盒均购自Thermo公司；BMP-2免疫组织化学试剂盒购自Abcam公司；GAPDH购自CST公司；HRP标记的抗兔（鼠）IgG购自上海碧云天公司；DAB浓缩型试剂盒购自上海长岛生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肝纤维化模型的制备和取材 清洁级喂养SD大鼠，随机分为正常对照组6只，肝纤维化模型组18只。肝纤维化模型组给予皮下注射40%的四氯化碳溶液0.3 mL/100 g，每周3次，持续注射12周。正常对照组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液，每周3次，持续注射12周。肝纤维化模型组大鼠分别于4、8、12周处死，正常对照组于12周处死，留取血清和肝脏组织-80℃保存；部分肝组织以10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，制备组织切片。

1.2.2 肝脏组织病理学检查 HE染色和Masson染色肝组织石蜡切片后，光学显微镜下观察肝组织病理改变情况。按2000年《病毒性肝炎防治方案》中慢性肝炎的分期标准，判定肝纤维化程度，若出现正常肝小叶结构破坏或消失，增生的纤维组织分隔、包绕肝细胞，纤维间隔见大量炎症细胞及成纤维细胞等浸润，表明肝纤维化模型成功建立。

1.2.3 肝纤维化指标检测 放射免疫法测定大鼠血清LN和HA的变化。

1.2.4 Real-Time PCR檢测大鼠肝组织BMP-2 mRNA的表达 取适量-80℃冷冻肝组织标本，按试剂盒说明书抽提总RNA，反转录合成cDNA。Real-Time PCR扩增BMP-2 mRNA。以3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参照基因。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。BMP-2上游引物：5'-CTGTCCCTACTGATGAGTTTC-3'，下游引物：5'-CTAACCTGGTGTCCAATAGTC-3'，产物长度174 bp。GAPDH上游引物：5'-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下游引物：5'-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3'，产物长度181 bp。用2 -△△CT值表示mRNA的相对表达量。

1.2.5 免疫组织化学法检测肝组织BMP-2的表达 将经甲醛固定、石蜡包埋标本制成5 μm厚的切片。采用过氧化物酶标记链霉亲和素（SP）法。60℃烤片，脱蜡水化，3%过氧化氢溶液温育阻断内源性过氧化物酶，高压修复，冷却后滴加BMP-2一抗，4℃温育过夜。滴加二抗及SP试剂，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。以PBS代替一抗作为阴性对照，用IMS图像分析系统测量肝组织平均吸光度值（积分吸光度/组织面积）代表蛋白表达水平。

1.2.6 Western blot法检测肝组织BMP-2的表达 采用RIPA快速裂解液抽提各组大鼠肝组织总蛋白，于-80℃保存。BMP-2一抗浓度按1：1000稀释，GAPDH一抗浓度按1：1500稀释。二抗均为1：1000稀释，ECL 增强化学发光法显示蛋白条带，显影、定影后保存图像。

1.3 统计学方法

用SPSS 18.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用（x±s）表示。数据服从正态分布者多组间比较采用单因素方差分析，样本方差齐性用Levene法检验，方差齐性者两两比较采用LSD法，方差不齐者用Dunnett T3检验。双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肝脏病理组织学变化

大鼠肝组织经HE及Masson染色后，普通光学显微镜下观察：正常对照组肝小叶结构清楚，肝细胞形态正常，以小叶中央静脉为中心向四周呈放射状排列，肝小叶内未见纤维组织形成，无炎症细胞浸润。肝纤维化模型组肝小叶结构破坏或消失，增生的纤维组织分隔、包绕肝细胞，部分肝细胞核大或双核，有坏死出血，纤维间隔见炎症细胞浸润。见封三图1、图2。

2.2各组大鼠血清LN、HA检测结果

肝纤维化模型组血清LN、HA逐渐升高，于12周时达高峰，与正常对照组比较，肝纤维化模型组各时间点LN、HA的差异均有统计学意义（LN的t值分别为-9.387，-12.310，-22.710；HA的t值分别为-104.110，-177.660，-284.110，P均<0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠肝组织中BMP-2 mRNA的表达

对照组和肝纤维化模型组中BMP-2 mRNA均有表达。模型组4周时BMP-2 mRNA表达与对照组无显著差异（t=0.004，P>0.05），模型组8周、12周较对照组显著下降（P均<0.05）。与模型组4周相比，模型组BMP-2 mRNA的表达在8周、12周显著下降（P均<0.05），12周达最低。见表2。

2.4免疫组织化学检测结果

BMP-2在各组大鼠肝组织中均有阳性表达，表现为细胞质内棕黑色或棕黄色颗粒沉积。与对照组相比，BMP-2在肝纤维化模型组12周时表达细胞数最少且着色最淡。见封三图3。

2.5各组大鼠肝组织BMP-2蛋白的表达

Western blot法检测结果显示，在对照组和肝纤维化模型组中BMP-2蛋白均有表达。模型组4周时BMP-2蛋白表达与对照组无显著差异（t=-0.068，P>0.05），模型组8周、12周较对照组显著下降（P均<0.05）。与模型组4周相比，模型组8周、12周显著下降（P均<0.05），12周达最低。这与Real-Time PCR检测BMP-2 mRNA表达结果一致。见表3，图1。

3讨论

肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种修复反应。任何破坏肝脏内环境稳定的过程如炎症、化学毒物和毒性药物、先天性代谢障碍、先天性异常等均可导致肝纤维化，引起细胞外基质（ECM）、细胞群和细胞因子的复杂改变[3]，出现肝脏内纤维结缔组织异常沉积[4，5]，过度的纤维化最终导致肝硬化、门静脉高压和肝衰竭[6]。CCl4是氯化烷烃类化合物，可选择性损害肝、肾功能，诱导形成的化学性肝纤维化动物模型与人类肝纤维化病程相似。

骨形成蛋白2（BMP-2）是天然骨形成蛋白提取物中最主要的形式，位于第20号染色体p12区，是影响免疫调节、细胞增殖、分化和凋亡的重要因子[7]。目前对BMP-2的研究大多集中在骨骼系统、肺、肾、眼、恶性肿瘤等方面[8，9]。体外实验表明，BMP-2可影响成骨细胞的增殖和分化[10-12]。Shlyonsky V等[13]报道BMP-2参与肺纤维化的发生、发展过程。在人动脉粥样硬化的钙化斑中已经检测到了BMP-2 mRNA，推测BMP-2与动脉粥样硬化密切相关[14]。Yang YL等[15]认为BMP-2通过延缓间质-上皮细胞转化（EMT）抑制肾间质纤维化。姚海佩等[16]认为在眼科诸多纤维化疾病如角膜溃疡、青光眼等中，BMP-2参与了不同的功能性细胞转分化成为成纤维细胞的过程，并抑制纤维化进程。有研究报道，BMP-2参与胰腺炎的炎症、纤维化反应[17]，通过Smad1信号通路拮抗TGF-β的作用抑制胰腺纤维化[18]。BMP-2通过AKT和ERK信号通路在胃癌中进行上皮间质转化，从而促进胃癌的侵袭和转移[19]。

本研究发现BMP-2 在正常对照组大鼠肝组织中有表达，在CCl4诱导建立大鼠肝纤维化模型的初期，即模型组4周时，大鼠肝组织中BMP-2 表达与对照组无显著差异，随着大鼠肝纤维化的加重，模型组8周、12周BMP-2表达逐渐减少，12周达最低。免疫组织化学证实，BMP-2在肝纤维化模型组较对照组大鼠肝组织中表达减少。综上所述，考虑BMP-2可能参与肝纤维化的发生、发展过程，并与肝纤维化的严重程度密切相关。这与姚颐等[20]研究发现的随着肾纤维化的进展，BMP-2表达显著下调的结果相似。

肝纤维化是诸多慢性肝病共同的病理过程，存在复杂的细胞因子网路调控。肝纤维化机制的研究是为肝纤维化治疗提供依据。本实验结果表明，BMP-2在正常SD大鼠肝脏有表达，随着肝纤维化进展，表达减少，提示BMP-2参与肝纤维化的发生、发展过程，在肝纤维化中可能扮演抑制的角色。但BMP-2如何影响纤维化基因表达与组织纤维化的分子机制，尚有待进一步的研究。

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（收稿日期：2017-05-20）