DSPE-LC-MS/MS法测定海红果中9种杀菌剂残留量

许慧娇

（乌兰察布职业学院，内蒙古乌兰察布012000）

DSPE-LC-MS/MS法测定海红果中9种杀菌剂残留量

许慧娇

（乌兰察布职业学院，内蒙古乌兰察布012000）

建立分散固相萃取（DSPE）-液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）测定海红果中9种杀菌剂（嘧霉胺、百菌清、稻丰散、甲霜灵、三唑酮、五氯硝基苯、烯酰吗啉、咪鲜胺、苯醚甲环唑）残留量的检测方法。样品匀浆粉碎后经乙腈提取、氧化铝萃取剂净化后，采用Atlantis T3色谱柱分离，LC-MS/MS测定。结果表明：9种杀菌剂在5.0 μg/L～500 μg/L范围内，呈良好的线性关系，线性相关系数 R2≥0.999 3；检出限为 0.03 μg/kg～1.0 μg/kg，定量限为 0.1 μg/kg～3.0 μg/kg；回收率在80.4%～102.3%，相对标准偏差（RSD）在1.1%～5.8%之间。

杀菌剂；分散固相萃取；液相色谱-质谱；海红果

杀菌剂，又称杀生剂、杀菌灭藻剂、杀微生物剂等，是作为防治各种病原微生物的一类农药[1-2]。它在果蔬生产中发挥了防治病虫害、保证果蔬生长、稳定产量等作用，但其农药残留问题也日益突出，可对人体、环境造成危险或破坏。因此有必要对果蔬中杀菌剂残留量进行监督检测。目前关于果蔬中杀菌剂的检测方法有气相色谱法[3-4]、气相色谱-质谱法[4-7]、液相色谱-质谱法[8-9]，常用液液萃取、固相萃取（SPE）、固相微萃取（SPME），但其存在操作繁琐、费时、费用较高等问题。

分散固相萃取（DSPE）是将固相萃取吸附剂分散在样品提取液中，提高比表面积，促进吸附干扰组分，该方法较SPE具有更简便、快捷、成本小、萃取效果好等特点[10-13]，近年来已广泛应用到果蔬等作物中农药残留检测[10-14]。但是，采用分散固相萃取同时检测水果中杀菌剂的报道较少。

海红果，是我国特色果品，海红果营养丰富，药食同源，果实含可溶性糖、维生素C，还含有人体所需的多种微量元素，其中钙含量居水果之首，素有“果中钙王”之美称。本研究以海红果为研究对象，针对9种杀菌剂（嘧霉胺、百菌清、稻丰散、甲霜灵、三唑酮、五氯硝基苯、烯酰吗啉、咪鲜胺、苯醚甲环唑），采用DSPE进行样品前处理，研究不同提取溶剂及萃取吸附剂对提取净化效果的影响，建立了DSPE-液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）测定水果中9种杀菌剂的检测方法，可为果蔬中杀菌剂的检测提供方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

6460 Triple Quad型液质联用仪：美国Agilent公司；3K15型冷冻高速离心机：Sigma公司；KQ-500E型超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；Mix II型漩涡震荡器：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

嘧霉胺、百菌清、稻丰散、甲霜灵、三唑酮、五氯硝基苯、烯酰吗啉、咪鲜胺、苯醚甲环唑标准品（1000mg/mL，纯度均≥99%）：农业部环境保护科研监测所；乙腈和甲醇（色谱纯）：美国天地有限公司；乙酸铵（色谱纯）：Sigma公司；N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）、石墨化碳黑（GCB）：天津博纳艾杰尔科技有限公司；十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）：安捷伦科技（中国）有限公司；中性氧化铝（纯度99.5%）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 LC-MS/MS条件

色谱条件：色谱柱为Waters Atlantis T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相 A 为 0.05%甲酸溶液，流动相B为纯乙腈；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL；柱温为 30℃。梯度洗脱程序为：0.0～1.0min，80%A；1.0 min～3.0 min，60%A；3.0 min～5.0 min，10%A；5.0 min～6.5 min，20%A；6.5 min～8.0 min，80%A。

质谱条件：电离方式为ESI（+）；气流温度为350℃；气流速度为6 L/min；雾化气为45 psi（1 psi=6.895 kPa）；鞘气为N2，温度为350℃，流速为10 L/min；毛细管电压为4 000 V；喷雾电压为1 000 V，电子倍增电压为400 V；测定方式为选择反应监测方式（MRM）；其它质谱条件见表1。

表1 9种杀菌剂质谱条件Table 1 Mass condition of nine fungicides

续表1 9种杀菌剂质谱条件Continue table 1 Mass condition of nine fungicides

1.3 样品前处理

将待测样品粉碎，称取样品5 g（精度0.1 mg）于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，加入1 g氯化钠，涡旋1 min，超声萃取10 min，加入4 g无水硫酸镁，涡旋震荡2 min，10 000 r/min离心5 min，取5.0 mL上层清液，加入1 g氧化铝涡旋1 min，10 000 r/min离心5 min，取上层清液，过0.22 μm微孔滤膜，滤液供LCMS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 DSPE提取溶剂的选择

考察了乙腈、甲醇、丙酮作为DSPE提取溶剂对9种杀菌剂的提取效果，结果见图1。

图1 提取溶剂的选择Fig.1 Selection of extraction solvent

从图1中可知：以乙腈作为提取溶剂时，提取率在80.1%～93.7%，提取率平均值为88.1%，高于甲醇（72.2%）和丙酮（69.3%），这可能是由于乙腈对不同极性的农药均有一定程度的溶解能力，适合于多种类农药残留的提取[12-16]；甲醇和丙酮作为提取溶剂时，提取液较为浑浊，而乙腈作为提取溶剂时，提取液较为澄清透明，这可能是由于乙腈极性较强，可使蛋白质变性，从而净化效果较好。因此提取溶剂选择乙腈。

2.2 DSPE吸附剂的选择

考察了N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）、十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）、石墨化碳黑（GCB）和中性氧化铝4种分散固相萃取吸附剂对海红果中9种杀菌剂的净化回收效果，结果见图2。

图2 DSPE吸附剂种类的选择Fig.2 Selection of the adsorbent of DSPE

从图2中可知：以PSA为吸附剂时，可有效去除样品中的糖类、脂肪、色素，9种杀菌剂回收率在65.7%～92.8%之间；以C18为吸附剂时，可有效去除糖类、亲脂型杂质，但对苯醚甲环唑的保留作用较强，从而造成苯醚甲环唑回收率低，杀菌剂回收率在62.1%～91.7%之间；以GCB为吸附剂时，可有效去除各种色素，但对含有苯环官能团的目标物（五氯硝基苯、烯酰吗啉、咪鲜胺、苯醚甲环唑）有很强的吸附，回收率小于50%；以中性氧化铝为吸附剂时，可有效去除芳香族和脂肪族的化合物，杀菌剂回收率在78.1%～98.6%之间。考虑回收率和净化效果，本研究DSPE吸附剂的选择中性氧化铝。

2.3 线性范围、检出限与定量限

将9种杀菌剂混合标准溶液分别配制为2.5、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 μg/L 系列浓度的标准工作液，以9种杀菌剂标准溶液的质量浓度（x）为横坐标、定量离子的峰面积（y）为纵坐标，绘制线性关系曲线，对测定结果进行线性相关分析见表2。

结果表明：9 种杀菌剂在 5.0 μg/L～500.0 μg/L 浓度范围内，线性关系良好（R2≥0.999 3），可以满足定量分析的要求。根据3倍信噪比计算9种杀菌剂的方法检出限（S/N=3）为 0.03 μg/kg～1.0 μg/kg；根据10倍信噪比计算9种杀菌剂的方法定量限（S/N=10）为0.1 μg/kg～3.0 μg/kg，满足果蔬中痕量农药的检测要求。

表2 9种杀菌剂的回归方程、相关系数、检出限及定量限Table 2 Regression equation，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of 9 fungicides

2.4 回收率与精密度

采用海红果空白样品，进行 5.0、250.0、500.0 μg/kg 3种浓度加标回收率和精密度试验，按照上述所建方法进行进行测定，每个浓度重复6次，回收率和精密度数据见表3，空白海红果9中杀菌剂加标的总离子流色谱图见图3。

表3 空白样品基质加标回收率Table 3 Recovery rate of blank sample

图3 空白海红果加标总离子流色谱图Fig.3 TIC chromatogram of Malus micromalus makino of added standard

结果表明：9种杀菌剂的加标回收率在80.4%～102.3%之间，相对标准偏差（RSD）在1.1%～5.8%之间，这说明该方法符合方法学的要求，且准确度高、精密度好。

2.5 实际样品的测定

采集市售海红果30份，按照1.3样品前处理进行处理，按照1.2 LC-MS/MS条件进行测定，结果表明：30份测试样中，9种杀菌剂阳性检出率3种，按照检出率高低顺序依次为：苯醚甲环唑（23.3%）＞咪鲜胺（13.3%）＞烯酰吗啉（6.7%），其余6种杀菌剂均未检出；市售海红果中，苯醚甲环唑的残留情况最为严重，7份海红果样品检出苯醚甲环唑残留，残留量高达217.3 μg/kg。根据GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》各类水果中杀菌剂最大残留量要求，30份样品中9种杀菌剂均未超标，但存在一定的食品安全风险，若长期食用残留杀菌剂的果蔬可对人体产生危害。

3 结论

建立分散固相萃取（DSPE）-液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）测定海红果中9种杀菌剂（嘧霉胺、百菌清、稻丰散、甲霜灵、三唑酮、五氯硝基苯、烯酰吗啉、咪鲜胺、苯醚甲环唑）残留量的检测方法。结果表明：9种杀菌剂在5.0 μg/L～500 μg/L范围内，呈良好的线性关系，线性相关系数 R2≥0.999 3；检出限为 0.03 μg/kg～1.0 μg/kg，定量限为 0.1 μg/kg～3.0 μg/kg；回收率在80.4%～102.3%，相对标准偏差（RSD）在 1.1%～5.8%之间。该方法可同时测定9种杀菌剂残留量，且具有操作简单、回收率高、精密度好、灵敏度好等特点，满足果蔬中农药残留量的分析要求，可为政府行政监督提供检测技术支持。

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Determination of Nine Fungicides Residues in Malus micromalus makino by Dispersive Solid Phase Extraction and Liquid Chromatography Mass Spectrometry

XU Hui-jiao
（Ulanqab Vocational College，Ulanqab 012000，Inner Mongolia，China）

A method were developed for determination of nine fungicides（pyrimethanil，chlorothalonil，phenthoate，metalaxyl，triadimefon，pentachloronitrobenzene，dimethomorph，prochloraz and difenoconazole）in Malus micromalus makino by dispersive solid phase extraction（DSPE）and liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）.The sample were homogenized and extracted by acetonitrile and purified by alumina extractant，and separated by Atlantis T3 column，and determined by LC-MS/MS.The results showed that the standard curves of nine fungicides showed good linear responses in the range of 5.0 μg/L-500.0 μg/L，and the linear correlation coefficient R2were no less than 0.999 3；the limits of detection were in the range of 0.03 μg/kg-1.0 μg/kg，and the limit of quantification were in the range of 0.1 μg/kg-3.0 μg/kg；the rate of recovery were in the range of 80.4%-102.3%，and the relative standard deviation（RSD）were in the range of 1.1%-5.8%.

fungicide；dispersive solid phase extraction；liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）；Malus micromalus makino

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.037

2017-01-12

许慧娇（1985—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：农产品加工及贮藏工程。