油菜花粉多糖羧甲基化分子修饰及其抗氧化研究

姚秋萍，卫亚丽，杨琼，卢庆祝

（贵州民族大学化学与生态环境工程学院，贵州贵阳550025）

油菜花粉多糖羧甲基化分子修饰及其抗氧化研究

姚秋萍，卫亚丽，杨琼，卢庆祝

（贵州民族大学化学与生态环境工程学院，贵州贵阳550025）

以油菜花粉多糖为原料，采用氢氧化钠-氯乙酸法，分别在0.5 mol/L和2.0 mol/L NaOH浓度条件下对油菜花粉多糖（rape pollen polysaccharides，RPP）进行羧甲基化修饰，并对其清除羟自由基（·OH）、超氧阴离子自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力进行研究。结果表明：羧甲基与油菜花粉多糖形成羧甲基化合物，得到取代度分别为0.47和0.55的2个改性产物，羧甲基油菜花粉多糖1（Carboxymethylated rape pollen polysaccharide1，CM-RPP1）和羧甲基油菜花粉多糖2（Carboxymethylated rape pollen polysaccharide 2，CM-RPP）2，RPP、CM-RPP1和CM-RPP2表现出不同程度的抗氧化活性，总的自由基清除能力大小为CM-RPP2＞CM-RPP1＞RPP。与未修饰油菜花粉多糖相比，羧甲基化修饰能提高油菜花粉多糖的体外抗氧化活性。

油菜花粉多糖；羧甲基化修饰；抗氧化活性

由物理因素、化学反应和代谢过程产生的自由基给机体带来很多病理性的影响，如引起DNA损伤、致癌作用、和衰老有关的细胞变性[1]。油菜多糖是油菜花粉的主要有效成分之一。药理研究表明，油菜花粉多糖具有增强免疫功能[2]、抗肿瘤[3]、抗氧化[4]等作用。

多糖羧甲基化即指向多糖大分子链上引入羧甲基基团，多糖羧甲基化能增大多糖的溶解度和电负性，可以提高多糖的水溶性，修饰后多糖有可能具有较修饰前更高的活性或者产生新的活性[5-9]。杏鲍菇多糖[10]、金银花多糖[11]、鸡腿菇多糖[12]、当归多糖[13]、黑木耳多糖[14]、灵芝多糖[15]经羧甲基化后抗氧化性能明显提高，羧甲基红枣多糖[16]可增强对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，羧甲基茯苓多糖[17]可以抑制乙肝病毒。目前对油菜花粉多糖的研究主要集中在提取、分离纯化本研究对油菜花粉多糖进行羧甲基化分子修饰等方面的研究，而对油菜花粉多糖的羧甲基化结构修饰的研究未见报道，并对其修饰前后的抗氧化活性进行研究，以期为油菜花粉的开发利用以及新型保健品的研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油菜花粉多糖（rape pollen polysaccharides，RPP），贵州民族大学化学与环境科学学院药物与化学实验室自制，纯度为74.86%；透析袋（MD34型，截留分子量 8 000 Da～14 000 Da，进口分装）；乙酸、单氯乙酸、DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、NaOH、浓 HCl、无水乙醇、95%乙醇、抗坏血酸、邻苯三酚、三（羟甲基）氨基甲烷、FeSO4、水杨酸、H2O2等均为分析纯。

1.2 主要仪器

HH-6数显恒温水浴锅：常州博远实验分析仪器厂；旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；电子分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；756PC紫外可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；傅里叶Nicolct6700型红外光谱仪：上海莱睿科学仪器有限公司。

2 方法

2.1 油菜花粉多糖的羧甲基化分子修饰

采用氢氧化钠-氯乙酸反应体系[18]。准确称取1 g油菜花粉多糖，分别溶于不同浓度（0.5、2.0 mol/L）的NaOH溶液中，剧烈搅拌下缓慢加入6 g的单氯乙酸，混合均匀后在60℃条件下继续搅拌反应3 h，冷却，用冰乙酸（或NaOH溶液）中和溶液的pH值为7.0，过滤，滤液透析72 h，冷冻干燥得到羧甲基化油菜花粉多糖[Carboxymethylated rape pollen polysaccharide1（CMRPP1），Carboxymethylated rape pollen polysaccharide 2（CM-RPP2）]。

2.2 羧甲基化油菜花粉多糖取代度（DSCM）的测定

采用酸碱滴定法[19]。精确称量10 mg羧甲基化油菜花粉多糖样品，于100℃干燥1 h后转入锥形瓶中，加入3 mL 70%乙醇，混匀后放置5 min。再依次加入10 mL的H2O，50 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液。混合后搅拌直至样品溶解。然后用浓度为0.1mol/L盐酸滴定，酚酞作为指示剂，计算每克羧甲基化油菜花粉多糖所需盐酸的毫摩尔数（A）：

其中：V0代表加入的NaOH的体积，mL；V2代表测定消耗的HCl的体积，mL；V1代表空白测定所消耗的盐酸的体积；M0代表加入的NaOH的浓度；M代表HCl的浓度；W为样品的质量，g。

羧甲基取代度（DS）计算公式如下：

2.3 红外光谱分析

采用KBr压片法，分别测定RPP、CM-RPP1、CMRPP2的红外光谱。波数范围为4 000 cm-1～400 cm-1，仪器分辨率为0.5 cm-1，灵敏度为90，扫描次数为32/64。

图1 RPP的红外光谱图Fig.1 Infrared spectra of RPP

图2 CM-RPP1红外光谱图Fig.2 Infrared spectra of CM-RPP1

图3 CM-RPP2红外光谱图Fig.3 Infrared spectra of CM-RPP2

2.4 羧甲基化油菜花粉多糖对羟基自由基（·OH）的清除率

利用Fenton反应来引发产生羟基自由基[20]。在试管中依次加入1 mL 6 mmol/L水杨酸溶液、6 mmol/L FeSO4溶液，然后分别加入1 mL不同质量浓度的羧甲基化油菜花粉多糖水溶液，最后加入6 mmol/L的H2O2溶液1mL启动反应，静置30 min后于波长510 nm处测定其吸光度。以蒸馏水代替羧甲基化油菜花粉多糖溶液做空白对照，VC水溶液做阳性对照，对·OH清除率按下式计算：

式中：A0为空白吸光度；AX为样品吸光度。

2.5 羧甲基化油菜花粉多糖对超氧阴离子自由基的清除率

利用邻苯三酚发生自氧化反应引发产生超氧阴离子自由基[21]。在试管中依次加入浓度为50 mmol/L，pH8.2的Tris-HCl（即三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液）缓冲液4 mL，然后分别加入1 mL不同质量浓度的羧甲基化油菜花粉多糖水溶液，混匀后于25℃的水浴锅中放置10 min，加入预热至25℃的邻苯三酚（60 mmol/L）溶液0.1 mL，反应5 min后滴加2滴10 mol/L的盐酸终止反应，并于波长325 nm处测定其吸光度A1，同法测定用蒸馏水代替邻苯三酚后的吸光度A2，以及用1.0 mL蒸馏水代替样品溶液后测得的吸光度A0。VC水溶液做阳性对照，对的清除率按下式计算：

2.6 羧甲基化油菜花粉多糖对DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基的清除率

利用在波长517 nm处DPPH无水乙醇溶液紫色团的特定吸收峰原理来测定DPPH自由基的清除率[22]。在具塞试管中加入0.2 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液2 mL，再分别加入2 mL不同质量浓度的羧甲基化油菜花粉多糖水溶液，混均，室温下静置30 min后，于波长517 nm处测吸光度AI，同时测定2 mL 0.2 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液与2 mL 50%乙醇混合液的吸光度A0以及2 m不同质量浓度的羧甲基化菜花粉多糖溶液与50%乙醇混合后的溶液测定吸光度AJ。VC水溶液做阳性对照，DPPH自由基的清除率按下式计算：

3 结果与分析

3.1 羧甲基化油菜花粉多糖的取代度

采用碱性-氯乙酸反应体系对油菜花粉多糖进行羧甲基化修饰，由公式计算出CM-RPP1、CM-RPP2的取代度分别为0.47、0.55。

3.2 红外光谱图分析

RPP、CM-RPP1和CM-RPP2的红外光谱图分别见图1、图2和图3。油菜花粉多糖的羧甲基化修饰产物仍具有多糖的特征红外吸收峰：3 400 cm-1附近处O-H的伸缩振动吸收峰、2 935 cm-1附近处C-H的伸缩振动吸收峰，1 240 cm-1附近处C-H变角振动吸收、1 039cm-1附近处的C-O-H平面弯曲振动吸收外；与图1比较，图2和3在1654.89 cm-1是羧基（-COOH）的C=O非对称振动吸收峰、1 412 cm-1处与羧基相连的甲基（-CH3）的C-H变角振动吸收、1 326 cm-1处C=O的对称伸缩吸收增强，并且随着羧甲基取代度的增加吸收增强，充分表明了羧甲基化油菜花粉多糖中羧甲基（-OCH2-COOH）的存在。从谱图上可以看出，羧甲基化后油菜花粉多糖的羟基峰（3 400 cm-1）的强度仅稍有减小，说明油菜花粉多糖仅有部分羟基被羧甲基化且取代度较低。

3.3 对羟基自由基的清除作用

CM-RPP1、CM-RPP2和RPP对羟基自由基的清除作用见图4。

图4 对羟基自由基的清除作用Fig.4 Scavenging capacity of RPP，CM-RPP1and CM-RPP2on hydroxyl free radicals

由图4可知，随着多糖浓度的增加，CM-RPP1、CM-RPP2和RPP对Fenton反应产生的羟基自由基的清除作用逐渐增强。相比较而言，CM-RPP2表现出更强的清除活性，但是清除能力均低于相同质量浓度的VC。

3.4 对超氧阴离子自由基清除作用

CM-RPP1、CM-RPP2和RPP对超氧阴离子自由基的清除作用见图5。

图5 对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.5 Scavenging capacity of RPP，CM-RPP1and CM-RPP2on superoxide anion free radicals

由图 5 可知，CM-RPP1、CM-RPP2和 RPP 对邻苯三酚自氧化体系产生的超氧阴离子自由基均表现出了一定的清除能力。当多糖浓度在0.2 mg/mL～1 mg/mL时，随浓度增加，CM-RPP1、CM-RPP2和 RPP 对超氧阴离子自由基清除率提高较快；当多糖浓度大于1 mg/mL时，CM-RPP1、CM-RPP2和RPP对超氧阴离子自由基清除作用平缓。

3.5 对DPPH自由基清除作用

CM-RPP1、CM-RPP2和RPP对DPPH自由基的清除作用见图6。

图6 对DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging capacity of RPP，CM-RPP1and CM-RPP2on DPPH free radicals

由图6可知，当多糖浓度在0.2 mg/mL～0.8 mg/mL时，CM-RPP1、CM-RPP2对 DPPH 的清除作用相当，而多糖浓度大于0.8 mg/mL时，CM-RPP2对DPPH的清除作用明显大于CM-RPP1，但是均大于RPP对DPPH的清除作用。

4 结论

本试验以油菜花粉多糖为研究对象，经羧甲基化修饰后得到CM-RPP1、CM-RPP22个修饰产物，取代度分别为0.47、0.55。红外光谱图谱说明羧甲基化油菜花粉多糖中羧甲基（-OCH2-COOH）的存在。体外抗氧化活性结果显示，油菜花粉多糖经羧甲基化修饰后对DPPH自由基、·OH和均具有较好的清除能力，并且呈现明显的量效关系。在相同浓度条件下，CMRPP1、CM-RPP2的清除能力均高于RPP，说明油菜花粉多糖经羧甲基化修饰后，抗氧化作用明显增强，特别是CM-RPP2表现出了更好的抗氧化活性。可能是由于油菜花粉多糖经过羧甲基分子修饰后，其空间结构发生了改变，使其抗氧化活性提高。关于羧甲基化油菜花粉多糖的构效关系有待进一步研究。

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Carboxymethylated Modification and Antioxidant Activity of Rape Pollen Polysaccharides

YAO Qiu-ping，WEI Ya-li，YANG Qiong，LU Qing-zhu
（School of Chemistry and Eco-Environmental Engineering，Guizhou Minzu University，Guiyang 550025，Guizhou，China）

Polysaccharides from rape pollen （RPP）was carboxymethylated by alkaline chloroacetic acid at 0.5 mol/L and 2.0 mol/L NaOH respectively to obtain carboxymethylated rape pollen polysaccharides（CM-RPP）.The scavenging capacities of hydroxyl free radicals，superoxide anion radical，1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl were assayed，with vitamin C （VC）as control.The results were that two carboxymethylated polysaccharides of RPP with degree of substitution （SD）of 0.47 and 0.55，named carboxymethylated rape pollen polysaccharide1（CM-RPP1）and carboxymethylated rape pollen polysaccharide 2（CM-RPP2），were obtained.RPP，CM-RPP1and CM-RPP2had certain scavenging ability to OH·free radical，·free radical and DPPH free radical.Total antioxidant activity was CM-RPP2＞CM-RPP1＞RPP.Compared with RPP，the antioxidant activity of polysaccharides in rape pollen can be improved through carboxymethylation.

polysaccharides of rape pollen；carboxymethylation modification；antioxidative activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.007

2017-06-01

贵州省科技合作计划项目（黔科合字[2015]7210）

姚秋萍（1978—），女（汉），副教授，博士，研究方向：食品化学，天然产物研究与开发。