水解方式对黄茧蚕丝多肽抗氧化活性的影响

包立军，彭云武，殷创，孙敏瑞

（1.安康学院陕西省蚕桑重点实验室，陕西安康725000；2.安康学院现代农业与生物科技学院，陕西安康725000）

水解方式对黄茧蚕丝多肽抗氧化活性的影响

包立军1，2，彭云武1，2，殷创2，孙敏瑞2

（1.安康学院陕西省蚕桑重点实验室，陕西安康725000；2.安康学院现代农业与生物科技学院，陕西安康725000）

以DPPH自由基清除率为指标，研究了天然黄茧家蚕品种“金丝一号”茧丝在盐水解、碱水解、酶水解3种不同提取条件下所获蛋白多肽的抗氧化功能活性差异。结果表明：盐水解法时，在40%CaCl2溶液、100℃、料液比为1∶20（g/mL）的提取条件下，蚕丝蛋白多肽DPPH自由基清除率平均为43.15%；碱水解法时，在4 mol/L NaOH溶液、100℃的条件下提取1 h，DPPH自由基清除率平均为45.62%。酶水解法时，加入1 000 U/g碱性蛋白酶，55℃处理4 h，蚕丝蛋白多肽DPPH自由基清除率平均为62.26%。天然黄茧蚕丝蛋白酶法水解物的抗氧化活性优于盐水解法和碱水解法。

天然黄茧；多肽；酶解；抗氧化活性

我国种桑养蚕、制丝织绸历史悠久。蚕丝是天然纤维中的珍贵品种，素有“纤维皇后”之称，是发展天然彩色织物的理想对象。天然有色茧丝是符合生态纺织品概念的一种天然纤维，因茧丝丝胶含有色素类物质而呈黄、绿等天然颜色，可免去纺织印染及该过程中各种助剂和染料的加入，实现环保无污染，近年来其发展备受关注。为满足消费者崇尚天然、环保、绿色的消费需求，育种工作者选育出一批如“金丝一号”[1]、“黄茧一号”[2]、“蜀黄一号”[3]、“金菊×明玉”[4]、“夏·黄×秋·色”[5]、“桂蚕 H9”[6]、“粤彩茧 1 号”[7]、“彩茧 1 号”[8]、“蜀·黄×川·白”[9]、渝黔黄茧[10]、湘彩黄 1 号[11]等彩色茧家蚕品种，人工饲育过程与普通白茧类似，有色茧茧质经济性状与白茧也相近，但可以减少传统丝绸生产工序，用彩色蚕茧直接缫丝织绸生产天然彩色丝绸服装。同时，研究发现天然有色茧丝具有较好的功能活性，Liang等对彩色茧丝的抗氧化性能进行的研究表明，天然彩色茧丝分解自由基的能力远远高于棉纤维和白茧丝，将彩色茧丝制成内衣或化妆品，有很好的护肤作用[12]。Chikara Hirayama等[13]从家蚕黄茧的乙醇提取物中分离得到了含有两种脯氨酸的栎皮黄酮类物质，有较强的抗菌[14]、抗氧化[15]活性。这些研究为天然有色茧丝的高附加值开发提供了试验依据。

本研究以陕西省蚕桑重点实验室野桑蚕与家蚕杂交选育而成的“金丝一号”品种天然黄茧为材料，以DPPH自由基清除率为检测指标，采用盐水解法、碱水解法、酶水解法3种方法分别制备蚕丝蛋白多肽，在单因素试验的基础上运用正交试验方法探讨了各自的最佳提取工艺，以期为天然黄茧蚕丝蛋白功能应用开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

天然黄茧：取自安康学院陕西蚕桑重点实验室天然黄茧品种“金丝一号”，鲜茧茧壳剪碎、清洗、干燥备用；无水氯化钙、盐酸、氢氧化钠、无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司陕西公司；透析袋、碱性蛋白酶：上海源叶生物科技有限公司；DPPH试剂：西安热默尔生物科技公司。

JY4002型电子天平：上海良平仪器仪表公司；PHS-3C型pH计：上海精科雷磁公司；UV752型电热恒温水浴锅：杭州汇尔仪器公司；TGL-16G型台式离心机：上海安亭科学仪器公司；BPZ-6033型真空干燥箱：上海一恒科学仪器公司；755B型紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器公司。

1.2 蚕丝多肽水解方法

1.2.1 盐水解法提取丝素蛋白溶液

精确称取1.00 g黄茧茧壳，加入CaCl2溶液，在单因素试验结果基础上按表1中的溶液浓度、温度、料液比水平进行提取，获得盐水解丝素蛋白溶液。

表1 盐水解正交因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment with saline solution

1.2.2 碱水解法提取丝素蛋白溶液

精确称取1.00 g黄茧茧壳，加入NaOH溶液，在单因素试验结果基础上按表2中NaOH浓度、温度、时间进行提取。提取结束后调至pH 7，过滤得碱水解丝素蛋白溶液。

表2 碱水解正交因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment with alkaline hydrolysis

1.2.3 酶水解法提取丝素蛋白溶液

精确称取1.00 g黄茧茧壳，加入碱性蛋白酶，在单因素试验结果基础上按表3中加酶量、温度和时间水平提取。提取结束后调至pH 7，过滤得酶水解丝素蛋白溶液。

表3 酶水解正交因素水平表Table 3 The factors and levels of orthogonal experiment with enzymatic hydrolysis

1.2.4 蚕丝蛋白多肽的透析纯化

将上述水解液放入透析袋中，自来水中透析2 d、蒸馏水中透析1 d。

1.2.5 蚕丝蛋白多肽的浓缩

将透析后的多肽液，在真空干燥箱中50℃干燥3 h。

1.2.6 DPPH法测定抗氧化活性

DPPH液配制：1 mg DPPH用少量无水乙醇溶解后蒸馏水定容至1 L，避光保存。

预试：试管中先加入2 mL DPPH液，加入各测试样。溶液呈无色时，加样量即为预试加样量值。

A0值测量：取DPPH液2 mL，加无水乙醇1 mL，充分混合，测A值（519 nm），即为A0值。

A值测量：取2 mL DPPH溶液，加入各测试样的预试加样量，再加入无水乙醇至总体积3 mL，混合，静置30 min后，测A值（519 nm）。

清除率计算公式：

DPPH 自由基清除率/%=（A0－A）/A0×100

2 结果与分析

2.1 盐水解丝素蛋白溶液最优提取方案的确定

选取底物浓度、温度和料液比进行三因素三水平L9（34）的正交试验，根据表1中所列正交试验的因素和水平试验方案，进行正交试验，结果分析见表4。

表4 盐水解丝素蛋白正交结果分析Table 4 The result of orthogonal experiment for silk fibroin with saline solution

正交试验结果表明，影响DPPH自由基清除率的因子顺序依次为：料液比>底物浓度>温度。制备丝素蛋白溶液的优化结果为A2B3C2，即在40%CaCl2溶液、100℃、料液比为1∶20（g/mL）的条件下提取。经3次试验验证，该条件下DPPH自由基清除率平均为43.15%。

2.2 碱水解丝素蛋白溶液最优提取方案的确定

选取底物浓度、温度和处理时间3个因子进行三因素三水平L9（34）的正交试验，确定最佳的碱水解丝素蛋白溶液最优提取方案。根据表2中所列正交试验的因素和水平的方案，进行正交试验，结果分析见表5。

从表5可以看出，影响DPPH自由基清除率的因子顺序依次为：底物浓度>处理时间>温度。制备丝素蛋白溶液的优化结果为A2B3C2，即在4 mol/L NaOH溶液中，在100℃的条件下提取1 h。经3次试验验证，该条件下DPPH自由基清除率平均为45.62%。

2.3 酶水解丝素蛋白溶液最优提取方案的确定

选取加酶量、温度和处理时间3个因子进行三因素三水平L9（34）的正交试验，确定最佳的酶水解丝素蛋白溶液最优提取方案。根据表3中所列正交试验的因素和水平的方案，进行正交试验，结果分析见表6。

正交试验结果见表6，影响DPPH自由基清除率的因子顺序依次为：加酶量>处理时间>温度。制备丝素蛋白溶液的优化结果为A2B2C2。即加入1 000 U/g的酶，在55℃处理4 h。经3次试验验证，该条件下DPPH自由基清除率平均为62.26%。

表5 碱水解丝素蛋白正交结果分析Table 5 The result of orthogonal experiment for silk fibroin with alkaline hydrolysis

表6 酶水解丝素蛋白正交结果分析Table 6 The result of orthogonal experiment for silk fibroin with enzymatic hydrolysis

3 结论

本试验采用盐水解、碱水解、酶水解3种方法获得天然黄茧蚕丝蛋白多肽，并比较了多肽的抗氧化活性。试验结果表明：盐水解法时，在40%CaCl2溶液、100 ℃、料液比为 1∶20（g/mL）的条件下提取，DPPH 自由基清除率平均为43.15%；碱水解法时，在4 mol/LNaOH溶液、100℃的条件下提取1 h，DPPH自由基清除率平均为45.62%；酶水解法时，加入1 000 U/g的碱性蛋白酶，55℃处理4 h，DPPH自由基清除率平均为62.26%。由此可见，天然黄茧蚕丝蛋白酶法水解物的抗氧化活性优于盐水解法和碱水解法。因此，在进行蚕丝蛋白抗氧化多肽应用中，应优先考虑酶法提取。

[1]胡必利,楚渠,彭云武.天然彩色茧蚕品种金丝1号的选育过程及特征特性[J].安徽农业科学,2010,38(8)：4031-4033

[2]彭云武,楚渠,胡必利.限性蚕品种黄茧一号的育成[J].陕西农业科学,2010,56(1)：58-59

[3]刘俊凤,刘彬斌,陈义安,等.天然彩色茧家蚕品种“蜀黄1号”的选育[J].江西农业学报,2014,26(6)：106-109

[4]包志愿,王新,崔自学,等.家蚕双限性金黄色茧品种金·菊×明·玉的选育[J].蚕业科学,2014,40(4)：652-659

[5]张明海,杨义,郑章云,等.彩色茧蚕品种“夏黄×秋色”饲育试验初报[J].蚕学通讯,2013,33(3)：7-9

[6]闭立辉,顾家栋,韦博尤,等.天然黄色茧家蚕品种桂蚕H9选育研究[J].广西蚕业,2013,50(1)：1-11

[7]吴福泉,肖阳,罗国庆,等.家蚕新品种粤蚕黄茧1号品比鉴定总结[J].广东蚕业,2011,45(3)：23-27

[8]普秀珍,黄平,朱水芬,等.天然黄茧品种彩茧1号在云南省实验室的鉴定试验[J].中国蚕业,2013,34(1)：31-34

[9]肖金树,张友洪,周安莲,等.限性黄茧品种“蜀·黄×川·白”的育成[J].蚕业科学,2008,34(4)：745-751

[10]罗朝斌,代方银,姜虹,等.桑蚕特殊用途品种渝黔黄茧的原蚕性状研究[J].贵州农业科学2009,37(6)：136-138

[11]艾均文,司马杨虎,薛宏,等.家蚕夏秋用四元杂交天然黄色茧新品种湘彩黄1号的选育[J].蚕业科学,2017,43(1)：45-55

[12]Liang H L,Ge J.Study on the Pigmentary Character of Natural Colorful Silk of Silkworm,Bombyx mori L[J].Silk Monthly,2005,6：20-22

[13]Hirayama C,Ono H,Tamura Y,et al.C-proliny lquercetins from the yellow cocoon shell of the silkworm,Bombyx mori[J].Phytochemistry,2006,67：579-583

[14]Kurio ka A,I shizaka H,Yamazaki M,et al.Lutein-binding protein from the Antibacterial activity of cocoon shells[J].Silk Sci Tech Jpn,1999,8：57-60

[15]Yamazaki M,Nakamura N,Kurioka K,et al.Antioxidative activity of ethanolic extracts of cocoon shell[J].Seric Sci Jpn,1999,68：167-169

Studies on Polypeptide Antioxidant Activity of Natural Yellow Cocoon by Different Hydrolysis Methods

BAO Li-jun1，2，PENG Yun-wu1，2，YIN Chuang2，SUN Min-rui2
（1.Shaanxi Key Laboratory of Sericulture，Ankang University，Ankang 725000，Shaanxi，China；2.College of Modern Agriculture and Biotechnology，Ankang University，Ankang 725000，Shaanxi，China）

To study the effect of polypeptide antioxidant activity of“Golden Silk I”natural yellow cocoon，DPPH radical scavenging rate was detected of the saline solution，alkali hydrolysis，or enzymatic hydrolysis's polypeptides.The results showed that the saline solution，under the conditions of 40%CaCl2solution，100℃，and solid-liquid ratio of 1∶20（g/mL），DPPH radical scavenging rate averaged 43.15%.Alkaline hydrolysis，under the conditions of 4 mol/L NaOH solution，1 h and 100℃，DPPH radical scavenging rate averaged 45.62%.Enzymatic hydrolysis method，under the conditions of joining 1 000 U/g enzyme，4 h and 55℃，DPPH radical scavenging rate averaged 62.26%.Antioxidant activity of using enzymatic hydrolysis was better than that of saline solution and alkaline solution.

natural yellow cocoon；polypeptides；enzymatic hydrolysis；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.004

2017-06-05

陕西省农业科技创新与攻关项目（2014K02-13-01）；安康市科技计划项目（2014AK01-11）

包立军（1982—），男（汉），副研究员，硕士，研究方向：桑育种及蚕桑资源综合开发研究。