甘草硒多糖对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的影响作用

滕 杨,王易男,刘冰雪,耿玉亭,李永吉

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨 150040; 2.佳木斯大学,黑龙江佳木斯 154007)

甘草硒多糖对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的影响作用

滕 杨1,2,王易男2,刘冰雪2,耿玉亭2,李永吉1,*

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨 150040; 2.佳木斯大学,黑龙江佳木斯 154007)

目的:探讨甘草硒多糖对CCl4诱导的小鼠肝损伤的影响作用。方法:采用CCl4建立小鼠急性肝损伤模型,通过测定各组小鼠血清中TP、ALB、ALT、AST、ALP、γ-GT的含量及肝组织匀浆中 MDA、GPX水平,并结合病理学HE染色,表明甘草硒多糖对小鼠急性肝损伤的影响。结果:中、高剂量甘草硒多糖与模型组比较可明显降低急性肝损伤小鼠血清中的AST(p<0.05)、ALP(p<0.05)及肝组织中的MDA(p<0.05)和GSH-Px(p<0.05)水平,高剂量组还可明显降低ALT(p<0.05)含量,改善CCl4所致的病理组织损伤。结论:甘草硒多糖对CCl4诱导的肝损伤有一定的保护作用,其机制可能是通过清除自由基而达到防治肝细胞损害的疗效。

甘草硒多糖,四氯化碳,急性肝损伤

甘草(Glycyrrhiza)属豆科(Leguminosae)多年生草本植物,又名乌拉尔甘草、甜草、甜根子等[1],其多糖(简称GP),主要由鼠李糖、葡聚糖、阿拉伯糖和半乳糖组成[2],含有大量的还原结构,决定其还原性强[3],从而阻止氧化损伤[4]。硒为谷胱甘肽过氧化物酶的核心组成成分,此酶催化还原型谷胱甘肽转化为氧化型谷胱甘肽,同时使有毒性的过氧化物还原为无害的羟基化合物[5],同时对肝炎病毒的突变有控制作用[6-7]。本文旨在将甘草多糖硒化后,通过对CCl4引起的小鼠急性肝损伤动物模型血清中特异酶指标测定和HE染色结果,考察中药甘草硒多糖(glycyrrhiza selenium polysaccharide,GSPS)的肝脏保护作用,为甘草的进一步开发提供基础实验数据,提高其经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF级昆明种小鼠 黑龙江中医药大学;联苯双酯滴丸 北京协和药厂;四氯化碳 天津市瑞金特化学品有限公司;白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)试剂盒 和光纯药工业株式会社;牛血清蛋白A-9647(BSA) Sigma;亚硒酸钠、考马斯亮蓝G-250 沈阳试三生化科技开发有限公司;还原型谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒 南京建成生物工程研究所;甘草多糖 纯度≥98%,本实验室提取并纯化;其他试剂 均为分析纯。

表1 小鼠血清中ALT、AST、ALP、ALB、γ-GT、TP的含量Table 1 The values of ALT,AST,ALP,ALB,γ-GT,TP in serum of mice(±s,n=3)

注：＊:p<0.05,与模型组组比较;*:p<0.05,与联苯双酯组比较;★:p<0.05,与空白组比较，表2同，肝重指数(%)=肝重/体重×100。

PUZS-300全自动生化分析仪 普朗医疗设备公司;AX224ZH/E天电子平 奥豪斯仪器常州有限公司;MYP11-2恒温磁力搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;LG10-2.4A型高速离心机 北京京立离心机有限公司;UV-1100紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;OXM1200C光学显微镜 日本尼康公司;F6/10型手动匀浆机 上海净信科技。

1.2 实验方法

1.2.1 甘草硒多糖的制备 制备方法同先前发表的山药硒多糖的制备方法[8]相同。

1.2.2 动物分组与给药 昆明种小鼠(SPF级),随机分为空白组,模型组,联苯双酯组,甘草硒多糖组、高、中、低甘草硒多糖组7组,每组8只,正常饲养一周后,空白组和模型组灌胃等量生理盐水,联苯双酯组灌联苯双酯组2 g·kg-1,甘草多糖组灌胃给药2 g·kg-1,高剂量组给药6 g·kg-1,中剂量组给药4 g·kg-1,低剂量组2 g·kg-1,连续灌胃给药7 d;第7 d给药1 h后,除空白组外,均腹腔注射0.2%的CCl4橄榄油溶液10 mL·kg-1;继续同上喂养7 d。

1.2.2 肝损伤指标的检测 第14 d灌胃给药4 h后,眼球法取血,离心15 min(3000 r·min-1),分离血清。按试剂盒说明利用PUZS-300全自动生化分析仪测定TP、ALB、ALT、AST、ALP、γ-GT含量;取相同部位肝脏0.2 g,用生理盐水漂洗,除去残留血液并用生理盐水配制成10%的组织匀浆液,手动匀浆,离心,取上清,按试剂盒说明的方法测定肝组织中GPx、MDA的含量。

1.2.3 组织病理学观察 取肝大叶用10%的甲醛固定,按常规方法制备切片,进行HE染色,光镜下进行病理学检查。

1.2.4 统计学处理 采用统计软件SPSS 18.0软件包进行统计分析,结果以x±s表示,组间比较采用One way ANOVA。

2 结果与分析

2.1 甘草硒多糖的得率与硒含量

按实验1.2.1方法合成10批甘草硒多糖,获得的硒多糖的平均产率为33.42%±1.24%,含硒量为3.11 mg·g-1。

2.2 鼠肝重指数

结果见表1,联苯双酯组和甘草中、高剂量治疗组和空白组比较肝脏指数无显著性差异;模型组与空白组比较有显著性差异(p<0.05),推测肝功能障碍会引起肝细胞破损,组织液流出,蓄积,导致组织肿大。

2.3 血清中各种酶及蛋白含量的测定结果

由表1可知,模型组小鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT水平较空白组明显升高,均有显著性差异(p<0.05);同时TP、ALB水平明显低于空白组,有显著性差异(p<0.05),说明CCl4引起的小鼠急性肝损伤的模型制造成功。联苯双酯组、空白组相比所有检测指标均无显著差异(p>0.05),说明联苯双酯滴丸有明显治疗作用。甘草硒多糖低、中剂量治疗组较联苯双酯组TP、ALB水平明显降低,TP、ALB、ALT、AST、ALP、γ-GT含量升高,均有显著性差异(p<0.05),说明干预治疗效果不佳,高剂量组与其无显著性差异,说明高剂量组治疗效果与联苯双酯组相当。

2.4 对肝组织中GSH-Px、MDA的含量测定结果

由表2可知,模型组与空白组比较,GSH、MDA含量显著升高(p<0.05),也表明本实验造模成功。联苯双酯对照组与模型组比较,GSH、MDA含量显著降低,说明联苯双酯组有治疗作用。甘草硒多糖中、低剂量组与联苯双酯组相比有显著性差异(p<0.05),与模型无显著差异;甘草硒多糖高剂量组与模型组相比可显著降低肝组织中GSH、MDA水平(p<0.05),表明较高浓度的甘草硒多糖对CCl4诱导的小鼠肝损伤具有明显的保护作用。

图2 肝组织HE染色Fig.2 The results of liver tissue by HE

表2 小鼠肝组织中MDA和GSH-Px含量Table 2 Values of MDA and GSH-Px in liver tissue

2.5 组织病理变化的影响

肝组织HE染色显示,空白组小鼠肝细胞束排列整齐,模型组肝细胞空泡变性,有宽大的纤维间隔,细胞基本被破坏。甘草硒多糖、联苯双酯滴丸治疗组肝细胞变性坏死较模型组明显降低,且甘草硒多糖高剂量组干预治疗效果明显与联苯双酯滴丸组相当,结果见图2。

3 结论与讨论

3.1 甘草硒多糖对CCl4诱导急性肝损伤血清中酶及蛋白含量的影响

甘草硒多糖对CCl4诱导的小鼠肝损伤的保护作用通过血清中各项指标TP、ALB、ALT、AST、ALP、γ-GT的变化来表征。肝损伤时体内会大量释放ALT、AST,导致两种转氨酶在小鼠体内含量大幅度提高。根据表1数据,模型组ALT、AST含量比空白组有显著增高,表明肝损伤模型造模成功,与前人研究结果一致[9]。甘草硒多糖高、中、低剂量治疗组血清中ALT、AST含量明显低于模型组。可能是甘草硒多糖有抗自由基作用,从而降低毒性药物CCl4引发的自由基大量释放所致ALT、AST含量升高,其中以高剂量组治疗效果最佳。

3.2 甘草硒多糖对CCl4诱导急性肝损伤肝组织中MDA及GSH-Px含量的影响

MDA和GSH-Px的测定是治疗药物是否有清除氧自由基,抑制脂质氧化的重要指标。肝组织中MDA的含量间接反应肝细胞损伤的程度[10]。MDA明显升高与GSH-Px降低,这两个指标的变化说明通过加速氧化和自由基的增加,导致大量自由基代谢产物聚集,增加肝细胞的损伤[11-12]。根据表2可得知,甘草硒多糖对CCl4所致肝损伤小鼠MDA的含量明显降低,高剂量组使GSH-Px含量明显增加。可推断出甘草硒多糖可通过清除自由基,降低脂质过氧化,达到治疗肝损伤的作用。

3.3 甘草硒多糖对CCl4诱导急性肝损伤病理切片的影响

通过肝组织HE染色显示,正常组小鼠肝细胞束排列整齐,模型组肝细胞空泡变性,细胞基本被破坏,主要原因是CCl4造模导致细胞膜和细胞器膜被破坏,组织液流出。甘草硒多糖、联苯双酯滴丸治疗组肝细胞变性坏死较模型组有改善,甘草硒多糖低剂量治疗组效果不明显,有较多细胞膜破裂,细胞质流出,治疗效果不佳;中剂量组织切片可观察到较多细胞核,细胞破裂现象减少;高剂量组效果最佳与联苯双酯滴丸组疗效相当,可清晰观察到细胞核,细胞组织完好。

经以上实验可知甘草硒多糖对CCl4所致肝损伤有防治作用,且治疗效果与用药浓度成正比,治疗效果甘草硒多糖高剂量组>甘草硒多糖中剂量组>甘草硒多糖低剂量组。在中药越来越现代化和国际化的大好形势下,希望通过此实验为中药资源利用和新药研究与开发提供实验依据。

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Effect of glycyrrhiza selenium polysaccharide on CCl4-induced injury in mice

TENG Yang1,2,WANG Yi-nan2,LIU Bing-xue2,GENG Yu-ting2,LI Yong-ji1,*

(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China; 2.Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Objective:To investigate the effect of glycyrrhiza selenium polysaccharide on acute liver injury induced by CCl4in mice. Methods:TP,ALB,ALT,AST,ALP,γ-GT levels in serum and GPX,MDA levels in liver tissues were examined. In addition,pathologic changes were examined by HE staining. Results:Glycyrrhiza selenium polysaccharide of middle and high dose can reduce the degrees of AST(p<0.05),ALP(p<0.05)in serum and MDA and GSH-Px(p<0.05)levels in liver tissue,and the ALT level in serum were decreased in high dose group,which can improve CCl4-induced pathological tissue damage. Conclusion:This study confirms licorice selenium polysaccharide on CCl4-induced acute liver injury has protective effect,the mechanism is likely to be reached by scavenging free radicals and prevent liver damage.

glycyrrhiza selenium polysaccharide;carbon tetrachloride;acute liver injury

2017-02-14

滕杨(1982-),女,在读博士,讲师,主要从事中药活性成分结构修饰及靶向递药系统研究,E-mail:tengyang19820405@163. com。

*通讯作者:李永吉(1957-),男,博士,教授,研究方向:中药药剂学研究,E-mail:liyongji2009@163.com。

佳木斯大学青年基金项目(sq2014-030)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)15-0311-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.058