副干酪乳杆菌VL8胞外多糖协同ConA对小鼠脾淋巴细胞增殖及细胞因子分泌的影响

陈杨扬,刘坤娜,李云姣,杜佳峰,霍 超,桑亚新,*

(1.河北农业大学食品科技学院,河北保定 071001;2.河北农业大学食品科技学院,河北保定 071001)

副干酪乳杆菌VL8胞外多糖协同ConA对小鼠脾淋巴细胞增殖及细胞因子分泌的影响

陈杨扬1,刘坤娜2,李云姣1,杜佳峰1,霍 超1,桑亚新1,*

(1.河北农业大学食品科技学院,河北保定 071001;2.河北农业大学食品科技学院,河北保定 071001)

本研究以前期从viili中分离得到的一株副干酪乳杆菌VL8为基础,对其胞外多糖(VL8-EPS)的免疫活性进行了初步探究。首先分离制备小鼠脾淋巴细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度的VL8-EPS对小鼠脾淋巴细胞增殖及在其与有丝分裂原共同作用下对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用;双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测细胞因子白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-6(IL-6)的含量。结果表明,VL8-EPS在浓度12.5～800 μg/mL范围内,能显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖;VL8-EPS协同刀豆蛋白(ConA)也显著地增强了脾淋巴细胞的增殖作用,且诱导效果高于单独施用VL8-EPS;并能显著促进协同ConA诱导的细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-6的分泌水平。综上，VL8-EPS显著地促进了脾淋巴细胞的增殖,并对ConA诱导的脾淋巴细胞的增殖有协同促进作用,还通过促进细胞因子的分泌发挥了免疫增强作用,说明VL8-EPS在一定程度上对免疫机制进行了调控。

viili,胞外多糖,副干酪乳杆菌,脾淋巴细胞,细胞因子,免疫调控

viili是一种源自于芬兰的传统发酵乳制品,又叫Vilia、Filia,具有丝状或线状的组织,质地粘稠,组织细腻、风味独特,具有极其宜人的口味和较好的双乙酰风味。研究发现viili在发酵过程中形成一层较厚的黏液样物质,经证实是viili乳制品中副干酪乳杆菌[1]在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖[2]。viili中的这种胞外多糖具有降低血液胆固醇含量、抗肿瘤以及促进益生菌与肠黏膜的吸附等重要的生理活性[3]。乳酸菌菌株及其胞外多糖能够增强细胞介导的免疫反应,如促进T/B淋巴细胞增殖、NK细胞杀灭肿瘤活性、单核细胞吞噬能力、促有丝分裂、释放细胞因子,从而增强宿主对致病菌的免疫防护作用[4-6]。大量的研究[7-9]表明乳酸菌胞外多糖主要用于研究食品和医药行业作为免疫增强剂来调节机体免疫能力。

脾脏作为机体最大的免疫器官,主要是T、B淋巴细胞的聚集场所,而T、B淋巴细胞是机体免疫活性细胞,其激活、分化、增殖在免疫应答过程中起着重要的作用[10-11]。目前,国内外有关乳酸菌胞外多糖的研究较多,但是有关VL8-EPS对体外培养小鼠脾淋巴细胞的免疫调节作用的研究鲜见报道。因此,本实验是以VL8-EPS为研究对象,研究VL8-EPS对小鼠脾淋巴细胞的增殖及诱生细胞因子的影响,对VL8-EPS的免疫调节作用做初步探究,以期为VL8-EPS提高免疫作用机制的研究及其开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

VL8-EPS 本实验室制备[2],不含蛋白、主要由中性多糖组成,其单糖组成为甘露糖∶半乳糖醛酸∶鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖为1∶2.05∶3.46∶49.66∶16.74;RPMI-1640培养基、刀豆蛋白(ConA)、四甲基偶氮唑盐(MTT) 北京索莱宝科技有限公司;无支原体新生牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司;IL-2、IFN-γ、IL-6试剂盒 南京建成生物工程研究所;其余化学试剂 均为分析纯;清洁级ICR(Institute of Cancer Research)小鼠 雌性,体重(20±2) g 北京华阜康生物科技有限公司。

MCO-18AC CO2培养箱 日本SANYO三洋有限公司;1500-823型酶标仪 Thermo Scientific公司;SW-CJ-1FD型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;YS100显微镜 Nikon仪器公司;Feb-80电动离心机 天津市华北实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脾细胞悬液的制备 参照文献[12-15],8～10周龄的小鼠眼球放血,脱颈致死,于75%乙醇内浸泡杀菌5 min,转移超净台内取脾脏,先用RPMI 1640培养液清洗干净,后转到200目钢网及培养皿内研磨,直至培养液发白为止,细胞悬液1000 r/min离心10 min。3倍体积红细胞裂解液裂解2 min去除红细胞,沉淀用PBS清洗三次,离心后静置3 min。最后沉淀用1 mL含10%无支原体新生牛血清RPMI 1640 培养液重悬。取出上述细胞悬液0.1 mL于小离心管中,台盼蓝染色1 min后,血球计数板计数,调整细胞悬液浓度为5×106个/mL。台盼蓝染色检测细胞存活率大于95%。

1.2.2 VL8-EPS对脾细胞的增殖作用 MTT法观察VL8-EPS对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用。按上述方法制备脾细胞悬液,取80 μL加入96孔板中,实验分为空白对照组、VL8-EPS组(终浓度分别为800、600、400、200、100、75、50、25、12.5 μg/mL)以及VL8-EPS协同ConA组(ConA终浓度分别为5 μg/mL)。每组6个复孔,最后用RPMI 1640培养液调整总体积至160 μL。96孔培养板置于37 ℃含5% CO2培养箱中培养48 h,在终止培养前4 h,各孔添加5 mg/mL MTT 10 μL,置于CO2培养箱继续培养4 h后取出,加入90 μL甲瓒溶解剂[2]培养过夜,酶标仪检测570 nm处的吸光值,重复实验3次。

1.2.3 VL8-EPS协同ConA对小鼠脾细胞分泌细胞因子的测定 按上述方法制备脾细胞悬液加入24孔板中,每孔1 mL,实验分为ConA单独刺激组(0.1 mL终浓度5 μg/mL)和VL8-EPS协同ConA组(VL8-EPS终浓度分别为800、400、200、100、50 μg/mL),最后用RPMI 1640培养液补足体积至1.5 mL。24孔板置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h后,1000×g离心15 min,收集细胞培养上清液,按ELISA试剂盒操作说明测定脾细胞培养液中IL-2、IFN-γ、IL-6含量,重复实验3次。

1.2.4 统计分析 组间差异采用统计软件SPSS Statistics 17.0 作单因素ANOVA 处理,数据以均值±标准偏差表示,以p<0.05或p<0.01时,组间差异判断为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 VL8-EPS对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响

VL8-EPS对脾淋巴细胞增殖作用的影响结果如图1、图2所示。

图1 VL8-EPS对脾淋巴细胞增殖作用的影响Fig.1 Effect of VL8-EPS on proliferation of spleen lymphocyte注:与空白对照组相比,*:p<0.05,**:p<0.01。

图2 VL8-EPS协同ConA对脾淋巴细胞增殖的影响Fig.2 Effect of VL8-EPS cooperated with ConA on proliferation of spleen lymphocyte注:与ConA组相比,*:p<0.05,**:p<0.01，图3～图5同。

由图1可见,与空白组相比,单独施用不同浓度的VL8-EPS的吸光值有不同程度的增加,并且在一定浓度范围内有一定的剂量关系。在12.5～100 μg/mL低浓度范围内,VL8-EPS对脾淋巴细胞增殖作用缓慢,且不具有统计学意义,而当VL8-EPS浓度为200、400、600 μg/mL时,能显著地促进脾淋巴细胞增殖,吸光值比对照组分别提高了8.9%、12.5%和20.4%(p<0.01)。当浓度为800 μg/mL时,达到了最大吸光值,较对照组提高23.7%(p<0.01)。当VL8-EPS协同ConA作用时结果见图2,随着VL8-EPS浓度的增加,VL8-EPS与ConA共同作用对脾淋巴细胞增殖作用逐渐增强(p<0.05),并且在一定浓度范围内有剂量关系。当VL8-EPS浓度为400 μg/mL时,诱导效果最好,其吸光值比ConA单独刺激提高49.7%(p<0.01)。以上结果表明,在浓度12.5～800 μg/mL范围内的VL8-EPS能显著地促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,而且在协同ConA作用时,其诱导小鼠脾淋巴细胞增殖效果明显高于单独施用VL8-EPS。

2.2 VL8-EPS对小鼠脾细胞分泌细胞因子的影响

2.2.1 VL8-EPS对小鼠脾细胞分泌IL-2的影响 IL-2活化的CD4+T细胞产生的一种重要的T淋巴细胞生长因子,具有广泛的生物调节活性。同时IL-2与其受体结合后,能引起T细胞分化、增殖,促进细胞毒T细胞的杀伤作用,增强NK细胞活性[16],其分泌水平高低可以反映机体的免疫功能的强弱。图3为VL8-EPS对小鼠脾细胞分泌IL-2的影响。

图3 VL8-EPS对小鼠脾细胞分泌IL-2的影响Fig.3 Effect of VL8-EPS on IL-2 induction of spleen lymphocyte

由图3可知,不同浓度的VL8-EPS均可促进ConA诱导脾细胞分泌IL-2,其VL8-EPS协同ConA组的分泌量极显著高于ConA单独刺激组(p<0.01),并且随着VL8-EPS的浓度的增加而逐渐增大,具有量效关系。在多糖浓度为50 μg/mL时,IL-2的分泌量较对照组就提高了26.18%。由此说明,在50～800 μg/mL浓度范围内,VL8-EPS对小鼠脾细胞分泌IL-2具有促进作用。

2.2.2 VL8-EPS对小鼠脾细胞分泌IFN-γ的影响 IFN-γ作为体内重要的免疫调节因子具有多种生物活性,主要由活化的T细胞产生,能够增强Th1细胞活性和细胞免疫功能。VL8-EPS对小鼠脾细胞分泌IFN-γ的影响结果见图4。

图4 VL8-EPS对小鼠脾细胞分泌IFN-γ的影响Fig.4 Effect of VL8-EPS on IFN-γ induction of spleen lymphocyte

由图4可知,不同浓度的VL8-EPS均可促进ConA诱导脾细胞分泌IFN-γ,其分泌量显著高于ConA单独刺激组(p<0.01),并且随着VL8-EPS的浓度的增加而逐渐增大,具有一定量效关系。在较低多糖浓度时(50 μg/mL),IFN-γ的分泌量达到了292.34 pg/mL,在最大多糖浓度时,IFN-γ的分泌量为486.48 pg/mL,比对照组提高了146.17%。由此说明,在50～800 μg/mL浓度范围内,VL8-EPS对小鼠脾细胞分泌IFN-γ具有极显著的促进作用。

2.2.3 VL8-EPS对小鼠脾细胞分泌IL-6的影响 IL-6是细胞因子的重要组成部分,不仅能使B细胞前体成为产生抗体的细胞,能促进原始骨髓源细胞的生长和分化,增强自然杀伤细胞的裂解功能。而且还参与机体炎性反应促进免疫球蛋白的产生。VL8-EPS对小鼠脾细胞分泌IL-6的影响结果见图5。

图5 VL8-EPS对小鼠脾细胞分泌IL-6的影响Fig.5 Effect of VL8-EPS on IL-6 induction of spleen lymphocyte

由图5可知,100～800 μg/mL浓度范围内的VL8-EPS均可促进ConA诱导脾细胞分泌IL-6,其分泌量显著高于ConA单独刺激组(p<0.01),并呈现一定的量效关系。在多糖浓度为800 μg/mL时,IL-6的分泌量达到最大含量值279.30 pg/mL,比对照组提高了71.11%。由此表明,VL8-EPS对小鼠脾细胞分泌IL-6具有促进作用。

3 讨论

免疫调节系统是机体执行免疫应答的一个重要系统,淋巴细胞则是参与机体免疫应答的主要效应细胞[11]。脾脏淋巴细胞中含有T淋巴细胞和B淋巴细胞,它们均是机体的免疫活性细胞,其增殖是反映细胞免疫最直接的指标[17]。本实验研究发现,VL8-EPS对小鼠淋巴细胞的增殖作用显著,并在一定浓度范围内存在着量效关系。ConA是T淋巴细胞的有丝分裂原,作用于T细胞膜上的相应受体,主要促进T淋巴细胞的增殖[18]。刘翠平[19]等已经报道5～80 μg/mL的干酪乳杆菌LC2W胞外多糖可以显著地促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。刘佳[20]等在硒化乳酸菌胞外多糖免疫功能机制研究中发现,在250～800 μg/mL浓度范围内的硒化乳酸菌胞外多糖显著地促进了小鼠脾脏淋巴细胞增殖,表明硒化乳酸菌胞外多糖与ConA有协同作用。据顾笑梅[21]报道,乳酸菌Z222胞外多糖EPSⅠ单独作用小鼠脾细胞就能促进体外淋巴细胞增殖,且具有剂量依赖关系。EPSⅠ也可促进ConA诱导的体外小鼠淋巴细胞转化。本研究发现,VL8-EPS与ConA共同作用对小鼠脾淋巴细胞增殖反应具有明显的促进作用,由此推断VL8-EPS可能是淋巴细胞的有丝分裂原,通过诱导细胞分裂、促进淋巴细胞增殖,达到增强机体免疫能力的目的,对调节机体免疫发挥重要作用。

细胞因子(cytokine,CK)是免疫原、有丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质,具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能,是免疫系统重要的信息分子,在免疫调节中充当十分重要的角色[22]。1986年,Mosmann等[23]根据辅助T细胞活化后分泌细胞因子的不同将其分为Th1和Th2细胞,这两种辅助性T细胞均从Th0细胞分化而来,在免疫应答反应中维持相互平衡进而调节机体免疫。Th1细胞主要分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ等细胞因子,通过抑制Th2分化和促进Th1分化使Th1细胞处于优势,介导机体细胞免疫应答反应。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等细胞因子,主要通过促进Th2分化和抑制Th1分化使Th2细胞处于优势,介导体液免疫反应。Wei[15]等研究发现浒苔多糖可以增加T淋巴细胞中IFN-γ和IL-2的分泌。吴广枫[24]等还发现改性的双歧杆菌胞外多糖能显著提高IL-2、IFN-γ细胞因子的含量。郑乃珍[25]等研究发现猴头菇多糖在25～400 mg/L浓度范围内能显著协同ConA刺激Th1细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)和Th2细胞因子(IL-4、IL-6)的分泌,通过调节Th1/Th2平衡发挥免疫调节作用。且在癌症治疗中发现IL-2、TNF-α和IFN-γ分泌物增加可以增强身体的免疫功能和抗肿瘤的活动[26-27]。本研究发现,VL8-EPS协同ConA可以显著地促进小鼠脾细胞中IL-2、IFN-γ、IL-6因子的分泌,说明VL8-EPS可以调控机体的双重免疫功能。

4 结论

综上所述,VL8-EPS能够显著促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,并且可协同ConA促进脾淋巴细胞增殖,还对脾淋巴细胞培养液中细胞因子的分泌有促进作用。由此表明,VL8-EPS可能是通过促进淋巴细胞的增殖及细胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ的分泌发挥免疫增强作用,而关于VL8-EPS对免疫功能的影响及作用机制还需做进一步深入研究。

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Effect of exopolysaccharides fromLactobacillusparacaseiVL8 cooperated with ConA on spleen lymphocyte proliferation and induction of cytokine in mice

CHEN Yang-yang1,LIU Kun-na2,LI Yun-jiao1,DU Jia-feng1,HUO Chao1,SANG Ya-xin1,*

(1.College of Food Science of Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China; 2.College of Food Science of Technology,Agricultural University of Hebei, College of Biological Engineering,2014 Undergraduate Students,Baoding 071001,China)

The strains oflactobacillusparacaseiVL8 was isolated form viili as base as described previously,futher researching of the immunomodulation of VL8-EPS was investigated. Firstly,preparation of mouse spleen lymphocytes and the proliferation of spleen lymphocytes in mice with different concentrations of VL8-EPS were determined by MTT. The contents of IL-2,IFN-γand IL-6 were determined by using ELISA. The results showed that VL8-EPS at a concentration ranging from 12.5 μg/mL to 800 μg/mL resulted in a significant increase of spleen lymphocyte proliferation,VL8-EPS could also enhance the effect of ConA-induced spleen lymphocyte proliferation and the induction effects was higher than that of single application of VL8-EPS. Moreover,VL8-EPS could significantly increase the secretion level of IL-2,IFN-γand IL-6 in ConA-induced spleen lymphocyte. In summary,VL8-EPS can effectively increase spleen lymphocyte proliferation and enhance the effect of ConA-induced spleen cell growth. VL8-EPS has the ability to enhance immune responses by increasing the secretion of cytokine. It showed that VL8-EPS could regulate the immune mechanisms partly.

viili;exopolysaccharides;lactobacillusparacasei;spleen lymphocyte;cytokine;immunoregulation

2017-02-21

陈杨扬(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：yangyangchen1991@163.com。

*通讯作者:桑亚新(1972-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物和农副产品综合加工利用，E-mail：Sangyaxin@sina.com。

国家公益性行业科研专项(201205031)；河北省科技厅科技支撑项目(15273202D、16227109D)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)15-0302-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.056