结直肠癌肿瘤微环境中调节性T细胞CD39、CD73亚群及二者双阳性亚群的临床意义

王东亮 戚 宁 牟冠男 张月桂

结直肠癌肿瘤微环境中调节性T细胞CD39、CD73亚群及二者双阳性亚群的临床意义

王东亮1戚 宁1牟冠男1张月桂2

目的 观察结直肠癌肿瘤组织微环境中浸润的调节性T细胞的临床意义，并探究其CD39、CD73及CD39，CD73双阳性亚群与肿瘤微环境中其他淋巴细胞及临床病理参数之间的关系。方法 收集24例结直肠癌患者根治术后组织标本，剪碎并分离培养组织内肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte，TIL)，以流式细胞术观察调节性T细胞CD39+、CD73+及CD39+CD73+亚群与患者临床病理参数之间的关联。结果 结直肠癌肿瘤组织微环境中浸润的调节性T细胞CD73+亚群，CD39+CD73+亚群与淋巴结转移及分化程度不良具有相关性，并且其机制与肿瘤相关性炎症密切相关。结论 相比Treg中的其他亚群，CD39+CD73+阳性的结直肠肿瘤浸润Treg具有更为独特的生物学活性，本研究为预测结直肠癌预后提供了新思路与理论依据。

结直肠癌；肿瘤浸润的淋巴细胞；调节性T细胞；CD39；CD73

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是目前最常见的恶性肿瘤之一。据最新数据表明，美国结直肠癌的发病率及死亡率在所有恶性肿瘤中均仅次于肺癌、前列腺癌和乳腺癌，高居第三位[1]；我国结直肠癌的发病率和死亡率近年呈不断升高的趋势，年死亡例数高达19万[2]。结直肠癌的高发病率和高死亡率对人类的健康及生命构成了严重的威胁。

由于结直肠癌的治疗已经进入瓶颈期，许多研究者开始着重对一些结直肠癌的预后指标进行研究。一方面寻找有力的预后指标，一方面验证这些指标能否成为干预因素，进而改善结直肠癌患者的预后，从而突破当前的治疗瓶颈。经过近些年大量研究证实，肿瘤浸润的淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte，TIL)的数量及种类可以作为指导肿瘤患者预后的确定因素[3]。TIL中有一种具有免疫抑制功能的调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)是TIL中的一种重要亚型，其在肿瘤组织中浸润的数量，功能导向与肿瘤的进展有着显著关联[4]。许多研究证实，TIL中的Treg是多种肿瘤的预后不良因素[5-6]。但在对结直肠癌及头颈部肿瘤的研究中，却发现其是保护性因素之一[7-8]。由于TIL中Treg群体具有独特的预后作用，目前已成为肿瘤免疫学研究方面的新热点[9-10]。而Treg的诸多免疫抑制功能中，例如通过其功能性表面分子，如CD39、CD73等，将肿瘤微环境中的ATP降解为腺苷，从而杀伤免疫效应细胞，使得肿瘤细胞能够逃逸免疫监视系统，促进肿瘤的进展及转移是近年间的研究热点[11-12]。本研究将从Treg TIL的CD39-CD73亚群进行研究，探究其是否具有独特的临床意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

本研究病例取自2014年3月10日—2014年6月18日于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院经结直肠癌根治术后的24例结直肠癌患者的临床及病理资料(表1)。所有患者术前均排除自身免疫性疾病，支气管哮喘，糖尿病，自身免疫性肝炎，肝硬化，甲状腺疾病等，且均未行化、放疗，生物及中医治疗等。所有检测标本术前均通过病理学诊断且证实为结直肠癌。

RPMI 1640购自Hyclone公司，胎牛血清购自GIBCO/BRL公司，青/链霉素购自碧云天公司，淋巴细胞分离液购自灏洋公司，乙酸佛波酯(PMA)购自Sigma公司，离子霉素(Ionomycin)购自Sigma公司，高尔基阻断剂(Golgi-stop)，Cytofix/Cytoperm solution Kit，CD45，CD4，CD8，CD25，CD127，CD39，CD73，IL-17A及BD FACS Aria II均购自BD Biosciences公司。

1.2 实验方法

手术切除的癌组织、癌旁组织(标准为癌边缘算起至5 cm处)、非肿瘤正常组织(距癌边缘算起大于5 cm以上处)各1块。装在无菌手术袋中在30 min内用4℃冰盒运至细胞间无菌室继续分离处理。在超净工作台无菌条件下用手术剪把组织剪成0.5～1 cm 2小块，其中1块浸入4%多聚甲醛固定液中用于组织切片染色和病理分析，所有结直肠癌组织从取材到分离为单个细胞均在2 h内，经过流式抗体标记后，细胞培养条件：37℃、5%CO2湿度培养箱，培养于含10%血清的1640培养基中，细胞抗体常温避光孵育，孵育后进行流式细胞检测。

1.3 检验方法

术前采集患者外周血及血清，送往哈尔滨医科大学附属肿瘤医院检验科检测血常规、生化及肿瘤标志物，所有检验人员操作技术熟练，持证上岗，质控全部在控，无不良事件发生。

1.4 统计学方法

应用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，组间均数比较采用两独立样本t检验或配对t检验，率的比较采用Fisher精确概率法，P<0.05认为差异有统计学意义，相关性应用Pearson 分析。图像分析运用Sigma Plot数据分析软件，做出组间比较条形图。Excel软件做出线形图。

表1 24例结直肠癌患者临床参数

2 结果

2.1 结直肠癌肿瘤浸润Treg及亚群与临床参数之间的关系

本研究分析了结直肠癌组织中CD45+、CD39+Treg、CD73+Treg、CD39+CD73+Treg中的表达情况与各临床病理参数之间的关系，经统计分析发现，Treg上述亚群占Treg的比率高低在各临床病理参数中并无差异(表2)。

表2 CD45+ Treg，CD39+Treg，CD73+Treg，CD39+CD73+Treg百分率与临床参数间的关系

Note：High and Low in the table are defined by mean.

2.2 流式检测结直肠癌肿瘤浸润Treg及其亚群的分布情况

本研究分析了结直肠癌(图1A)与癌旁正常组织(图1B)中CD4+CD25+CD127low细胞群体及其表面CD39、CD73分子的表达情况，癌旁正常组织中浸润的淋巴细胞为NIL(Normal Infiltrating Lymphocyte)。肿瘤组织制备的单细胞悬液先经CD45确定淋巴细胞并设门后，经CD4和CD25标记分析的结果如图1左侧所示，提取CD4+CD25+细胞，并进一步依据CD127的表达情况将细胞分为CD127high和CD127low两个亚群。进一步分析CD127low的亚群中表达有表面标记CD39和/或CD73的细胞。

2.3 结直肠癌组织及癌旁正常组织中Treg中CD39+、CD73+亚群的关系

相关性分析了结直肠癌中浸润的CD39+调节性T细胞与总调节性T细胞百分率呈负相关(r=-0.489，P<0.05)(图2A)；CD39+Treg在TIL中的表达显著高于癌旁正常组织(P<0.05)，CD39+CD73+Treg在TIL中的表达显著低于癌旁正常组织(P<0.05)(图2B)。

图1 结直肠癌组织及癌旁正常组织中Treg中 CD39+、CD73+亚群的关系Figure 1 The relationship between Treg and its CD39，CD73，CD39 CD73 subgroup in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissuesNote：A.A distribution of Tregs in TILs is reversely associated with CD39+ with CD73+ Tregs；B.A distribution of CD39+ Tregs and CD39+ with CD73+ Tregs was significant different in TIL and NIL.

图2 结直肠癌及其癌旁正常组织中CD4+CD25+CD127low细胞群体及其表面CD39、CD73分子的表达情况Figure 2 A distribution of tumor infiltrating CD4+，CD25+ and CD127low lymphocyte in colorectal cancerNote：A.cancer-adjacent normal；B.tissue specimens.

2.4 Th17及Tc17在结直肠癌TIL中的分布情况及其与CD39+CD73+Treg的关系

如图3所示，Th17(图3A)及Tc17(CD8+IL-17+)在TIL的分布情况。如图3C所示，CD39+CD73+Treg与Th17显著相关(r=0.517，P<0.05)。初步提示CD39+CD73+Treg与肿瘤局部Th17介导的炎症直接相关。

图3 Th17及Tc17在结直肠癌中TIL中的分布情况，及其与CD39+CD73+Treg的关系Figure 3 The distribution of Th17 and Tc17 in TIL of colorectal cancer and its relationship with CD39+ with CD73+ TregNote：A distribution shows the tumor infiltrating Th17(A)and Tc17(B)lymphocyte in colon cancer tissue specimens.The percentage of CD39+ and CD73+ Treg is linearly association in Th17 cells(r=0.517，P<0.05).

3 讨论

本文分析了结直肠癌肿瘤浸润调节性T细胞以CD39+CD73+为标记的腺苷通路的作用：调节性T细胞在肿瘤中的数量要高于其在相近的癌旁正常组织中的数量，CD39+CD73+调节性T细胞在肿瘤组织中的浸润数量显著低于其在癌旁正常组织中的数量；并且调节性T细胞总的数量与CD39+调节性T细胞数量呈负性相关(r=-0.489)，肿瘤浸润的CD39+CD73+调节性T细胞数量与肿瘤中浸润的Th17数量呈正相关(r=0.517)，初步提示了CD39+调节性T细胞的生物学行为——肿瘤中浸润的调节性T细胞数量较多，但其CD39+CD73+比率较低，且二者有负相关趋势，代表着CD39+CD73+调节性T细胞群体与其之外的调节性T细胞群体有着显著不同的生物学特性，本研究推测CD39+CD73+调节性T细胞可能抑制效应性T细胞，遏制其对肿瘤的攻击作用，并促进了Th17细胞的招募、聚集，分泌VEGF及IL6等分子，促进了肿瘤进展、转移；而调节性T细胞中非CD39+CD73+亚群，其功能可能与抑制肿瘤微环境中的炎性细胞为主，可能会对患者的预后起到保护作用。并且，本研究将肿瘤中浸润的CD39+CD73+调节性T细胞与临床参数之间进行统计学分析，发现其与肿瘤淋巴结转移、中低分化及更低的患者术前中性粒细胞绝对值与淋巴细胞绝对值的比值存在显著关联，更加印证了我们之前对其生物学行为的推测。

既往多项研究都认定结直肠肿瘤中浸润的调节性T细胞在结直肠癌中有着较为确定的保护性预后意义，但其具体机制仅存在假说支持，我们既往研究数据已证实此假说可能成立[13]。在调节性T细胞诸多抑制功能中，CD39-CD73-腺苷通路的相关研究报道尚少，我们通过流式细胞术观察到了结直肠癌肿瘤浸润的CD39+CD73+调节性T细胞亚群存在着强烈的潜在预后不良趋势，提示我们不可仅仅将结直肠癌肿瘤中浸润的调节性T细胞加以保护，依赖其对肿瘤局部破溃的表面发挥抗炎作用，而需要对其中的CD39+CD73+群体进行特异性抑制，方有可能遏制结直肠癌的局部进展及区域淋巴结转移。

本文以肿瘤免疫为切入点，探究肿瘤微环境中淋巴细胞亚群对结直肠癌患者预后的指导意义及其与临床病理参数之间的关联作为间接证据，寄希望于为当前的TNM指导预后方式进化为TNM结合肿瘤浸润淋巴细胞多个亚群数量及比例的综合评分模式，即TNM-Immunology，提供数据支持及理论依据。本文寄希望于一方面可以为结直肠癌的预后提供肿瘤免疫学证据，另一方面可能为结直肠癌从基础研究、临床转化研究到临床研究提供可干预靶点，突破现有的化学药品及靶向药物的治疗瓶颈。

1 Siegel RL，Miller KD，Fedewa SA，et al.Colorectal cancer statistics，2017[J].CA Cancer J Clin，2017，67(3)：177-193.

2 Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015[J].CA Cancer J Clin，2016，66(2)：115-132.

3 Donnem T，Kilvaer TK，Andersen S，et al.Strategies for clinical implementation of TNM-Immunoscore in resected nonsmall-cell lung cancer[J].Ann Oncol，2016，27(2)：225-232.

4 Takeuchi Y，Nishikawa H.Roles of regulatory T cells in cancer immunity[J].Int Immunol，2016，28(8)：401-409.

5 Ibrahim EM，Al-Foheidi ME，Al-Mansour MM，The prognostic value of tumor-infiltrating lymphocytes in triple-negative breast cancer：a meta-analysis[J].Breast Cancer Res Treat，2014，148(3)：467-476.

6 Singh M，Loftus T，Webb E，et al.Minireview：Regulatory T cells and ovarian cancer[J].Immunol Invest，2016，45(8)：712-720.

7 Zhuo C，Xu Y，Ying M，et al.FOXP3+Tregs：heterogeneous phenotypes and conflicting impacts on survival outcomes in patients with colorectal cancer[J].Immunol Res，2015，61(3)：338-347.

8 Shang B，Liu Y，Jiang SJ，et al.Prognostic value of tumor-infiltrating FoxP3+ regulatory T cells in cancers：a systematic review and meta-analysis[J].Sci Rep，2015，14(5)：15179.

9 Renner K，Singer K，Koehl GE，et al.Metabolic hallmarks of tumor and immune cells in the tumor microenvironment[J].Front Immunol，2017，8(8)：248.

10 Solinas C，Pusole G，Demurtas L，et al.Tumor infiltrating lymphocytes in gastrointestinal tumors：Controversies and future clinical implications[J].Crit Rev Oncol Hematol，2017，110：106-116.

11 Allard B，Longhi MS，Robson SC，et al.The ectonucleotidases CD39 and CD73：Novel checkpoint inhibitor targets[J].Immunol Rev，2017，276(1)：121-144.

12 de Oliveira Bravo M，Carvalho JL，Saldanha-Araujo F.Adenosine production：a common path for mesenchymal stem-cell and regulatory T-cell-mediated immunosuppression[J].Purinergic Signal，2016，12(4)：595-609.

13 Wang DL，Liu YY，Gu YL，et al.Increased number of forkhead box P3+ tumor-infiltrating lymphocytes correlates with high preoperative albumin level and better survival in patients with stage Ⅱ or Ⅲ colorectal cancer[J].Tumour Biol，2015，36(7)：5407-5414.

(收稿：2017-01-09)

Clinical significance of CD39 CD73 subsets and both of them positive subgroups of regulatory T cells in the microenvironment of colorectal cancer

WANGDongliang1，QINing1，MUGuannan2，ZHANGYuegui2

1.Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China；2.Harbin Medical University Cancer Institute

Objective The objectives of this study were to investigate the clinical significance of CD39，CD73，double positive subgroups for CD39 and CD73，and other lymphocytes with clinicopathological parameters in the microenvironment of colorectal cancer.Methods Tumor infiltrating lymphocyte(TIL)was collected from 24 patients with colorectal cancer after radical resection.The expression of CD39+，CD73+or CD39+with CD73+in T cells were measured by flow cytometry.The association between these subgroups and clinicopathologic parameters was analyzed.Results The CD73+and CD39+with CD73+subgroups were associated with lymph node metastasis and poor degree of differentiation，and this mechanism was closely related to tumor-associated inflammation.Conclusion CD39+with CD73+colorectal tumor infiltration Treg has a more unique biological activity than other Treg group.This study provides a new idea and theoretical basis for predicting the prognosis of colorectal cancer.

Colon cancer；Tumor-infiltrating lymphocyte；Regulatory T lymphocyte ；CD39；CD73

(收稿：2017-02-08)

黑龙江省教育厅科学技术研究(面上)项目计划(12541485)

1.哈尔滨医科大学附属肿瘤医院(哈尔滨 150081)；2.哈尔滨医科大学肿瘤研究所

王东亮，男，(1981-)，博士，主治医师，从事恶性肿瘤的免疫治疗及综合治疗的研究。

王东亮，E-mail：drwangdl@139.com

R574.62

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.04.008