节拍化疗通过影响血管形成及免疫系统抑制肿瘤细胞生长的机制

石 峰 于 雁

节拍化疗通过影响血管形成及免疫系统抑制肿瘤细胞生长的机制

石 峰 于 雁

目的 研究节拍化疗方案对乳腺癌肿瘤细胞的影响及其作用机制。方法 建立荷瘤小鼠模型，给予常规剂量卡培他滨化疗作为常规化疗组，持续低剂量卡培他滨化疗作为节拍化疗组，不应用化疗作为对照组。测定肿瘤血管微密度(Microvessel density，MVD)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、凝血酶敏感蛋白1(Thrombospondin 1，TSP-1)的表达情况，通过流式细胞仅检测不同化疗方案中骨髓来源抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)、NK细胞、巨噬细胞的比例，观察化疗结束后小鼠的肿瘤大小和血中白细胞计数。结果 节拍化疗组与常规化疗组比较，MVD、VEGF降低，TSP-1升高，差异有统计学意义(P<0.05)。节拍化疗组与常规化疗组比较，MDSCs比例降低，NK细胞、巨噬细胞的比例升高，差异有统计学意义(P<0.05)。节拍化疗组与常规化疗组在治疗结束后肿瘤体积没有区别(P>0.05)，但节拍化疗组小鼠白细胞计数明显高于常规化疗组(P<0.05)。结论 持续低剂量卡培他滨化疗通过抑制新生血管形成，调整免疫细胞的比例来抑制肿瘤形成，同时降低化疗引起的副反应，提高生存质量。

节拍化疗；血管抑制；免疫系统；生存质量

节拍化疗是一种采用低剂量持续性或高频率给药的治疗方案，最早由Browder等[1]在2000年提出，该方案使得患者在获得收益的同时副反应也能够降低，被认为是一种可以在常规化疗耐药后继续起效的方法。目前一些研究证明节拍化疗可以抑制肿瘤细胞血管内皮的增殖。上调内源性血管生成抑制因子、下调调节性T细胞、抑制血管内皮细胞的前体细胞、诱导血管内皮细胞凋亡或抑制增殖等均是其机制[2]。

乳腺癌对化疗相对敏感，患者的生存期相对较长，传统的化疗方法副作用较大，不良反应较重，部分患者在应用常规化疗方案后不能耐受其副反应而被迫停止治疗。如标准剂量的卡培他滨治疗手足综合征的发病率高达45%～68%，同时在两个化疗周期之间也存在着较长的时间间隔，可能使得部分肿瘤细胞再次生长，因而传统的治疗方法受到了不良反应的限制。

目前节拍化疗的机制研究主要集中在抗血管生成，近几年逐渐关注免疫系统调节在节拍化疗中的作用，部分研究证实一些药物在节拍化疗中小鼠的免疫细胞比例起到了变化[3-4]，但卡培他滨节拍化疗是否能够起到相似的作用研究较少。本研究旨在通过裸鼠抑瘤实验、免疫组化实验、细胞流式实验确定卡培他滨节拍化疗与传统化疗方案对乳腺癌肿瘤细胞的影响，明确节拍化疗的作用机制，与常规化疗比较其治疗效果和副反应有何不同，为乳腺癌患者提供新的选择。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

从美国模式菌种收集中心(ATCC)购入乳腺癌细胞系，放入黑龙江省肿瘤防治研究所保存。从北京维通利华公司购入BALB/c雌性小鼠，4～6周龄，体重15～20 g。从江苏正大天晴公司购入卡培他滨原研药粉。从北京中杉生物技术公司购入CD34、VEGF、TSP-1单克隆抗体及免疫试剂盒。Gr-1、CD16及F4/80抗体购自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤小鼠的建立 将45只4～6周的BALB/c裸鼠随机分为3组，每组15只裸鼠。在SPF级培养条件下培养裸鼠，每日观察裸鼠的一般情况，将肿瘤细胞悬液0.2 mL注入小鼠右后腹股沟皮下，约6×106细胞/只。观察肿瘤细胞在小鼠体内的成瘤情况，每隔7天测量肿瘤大小，按公式：V=a2b/2计算肿瘤体积(a：肿瘤短径，b：肿瘤长径)，同时检测小鼠静脉血中白细胞计数。

1.2.2 实验分组 将45只裸鼠随机分为三组，给予常规剂量卡培他滨化疗作为常规化疗组(MTD)，持续低剂量卡培他滨化疗作为节拍化疗组(LDM)。常规化疗组每日进行一次灌胃，按照人体和小鼠等效剂量换算，小鼠卡培他滨剂量为360 mg/kg，持续14天，间歇7天。将卡培他滨剂量由低到高给小鼠灌注，检测小鼠体内的循环内皮祖细胞(Circulating endothelial progenitor cells，CEPs)，当循环内皮祖细胞最低时确定为节拍化疗的药物剂量[5]，节拍化疗组每日一次灌胃，卡培他滨剂量为90 mg/kg，持续进行不间歇。不应用化疗作为对照组，观察三组小鼠6周后的治疗情况。

1.2.3 细胞流式检测不同免疫细胞比例 应用药物治疗后第14天，每组取出5只小鼠，切除肿瘤细胞，用PBS漂洗，将组织剪碎、混匀，用不锈钢过滤网去掉残渣，细胞悬浮在PBS液中，再用酶消化处理，离心，加入Gr-1、CD16及F4/80抗体，上流式细胞仪检测不同实验组骨髓来源抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)、NK细胞、巨噬细胞(Macrophages)的比例。

1.2.4 免疫组化染色 6周后处死三组中剩余裸鼠，统计肿瘤体积数据及白细胞计数，剥离肿瘤组织，用甲醛溶液在常温下固定，先用石蜡包埋然后切片，再进行CD34、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、凝血酶敏感蛋白1(Thrombospondin 1，TSP-1)免疫组织化学检测，用PBS作为空白对照。

1.2.5 结果判定 通过CD34单抗标记的内皮细胞观察肿瘤微血管密度(MVD)，内皮细胞胞浆被染成棕色，在400倍镜下随机计数5个视野内的数目，计算所有视野内数目的总数后取平均值。VEGF和TSP-1也呈棕黄色染色，计数随机3个视野内的数目，取平均值。

1.3 统计学分析

应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计量资料采用单因素方差分析、重复测量资料采用重复测量方差分析，计数资料采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同化疗方案对肿瘤免疫细胞的影响

流式细胞结果显示与常规化疗组和对照组比较，节拍化疗组骨髓来源抑制性细胞比例降低，NK细胞、巨噬细胞的比例升高，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 MDSCs、NK、巨噬细胞在不同化疗组中的比例

2.2 不同化疗方案的血管形成检测

与常规化疗组和对照组比较，节拍化疗组MVD、VEGF降低，TSP-1升高，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 各组免疫组化表达情况

2.3 不同化疗方案的抑瘤作用

接种肿瘤后第七天对照组肿瘤大小(246.7±19.1)mm3，节拍化疗组肿瘤大小(256.8±23.3)mm3，常规化疗组肿瘤大小(277.1±17.7)mm3，各组之间没有统计学差异。在应用不同方案化疗药物后前七天各组裸鼠肿瘤体积没有差异，治疗后第14天对照组肿瘤大小(1 843.5±327.4)mm3，节拍化疗组肿瘤大小(1 024.7±213.3)mm3，常规化疗组肿瘤大小(977.8±192.5)mm3，对照组与化疗组差异有统计学意义(P<0.05)，但常规化疗组与节拍化疗组无统计学意义(P>0.05)。治疗结束后对照组肿瘤大小(3 741.3±624.6)mm3，节拍化疗组肿瘤大小(2247.1±445.6)mm3，常规化疗组肿瘤大小(2 128.9±437.2)mm3，对照组的肿瘤体积大于常规化疗组和节拍化疗组，差异有统计学意义(P<0.05)，但常规化疗组与节拍化疗组无统计学意义(P>0.05)(图1)。

图1 裸鼠肿瘤生长曲线Figure 1 The volume of tumor in different groups

2.4 不同化疗方案的毒副反应

化疗开始前对照组白细胞数(8.91±1.12)×109/L，常规化疗组白细胞数(8.73±1.24)×109/L，节拍化疗组白细胞数(9.17±1.16)×109/L，各组之间没有统计学差异。化疗开始后常规化疗组白细胞数在治疗开始第14天后出现降低，随着治疗的进行白细胞数继续降低。节拍化疗组白细胞数在治疗开始第14天后出现轻度降低。治疗结束后对照组白细胞数(9.1±1.31)×109/L，常规化疗组白细胞数(4.45±1.25)×109/L，节拍化疗组白细胞数(7.27±1.08)×109/L，节拍化疗组白细胞数低于对照组，但明显高于常规化疗组，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

图2 不同组裸鼠白细胞计数Figure 2 The number of white blood cell in different groups

3 讨论

传统的化疗方案除了药物的细胞毒性起到了杀伤肿瘤细胞的作用以外，这样的化疗模式同时也对肿瘤再生长、肿瘤新生血管形成、肿瘤转移起到了作用[6-8]，因而这些年节拍化疗成为了研究热点。节拍化疗目前主要研究的作用机制是抑制肿瘤的新生血管形成，通过抑制VEGF，提高TSP-1发挥抗肿瘤作用。其中TSP-1是一种内源性血管内皮抑制因子，可以与CD36受体结合，从而阻止内皮细胞的增殖，而CD36阴性的细胞不会被TSP-1所抑制，因而节拍化疗可以特异性的作用于肿瘤细胞的血管生成，而不影响正常造血系统功能。同时，节拍化疗也可以抑制由循环前体内皮祖细胞转化而来的血管内皮细胞，这些内皮细胞进入循环系统后会在新生血管处转化为成熟的血管内皮细胞。有一些研究证明持续低剂量节拍化疗可以降低荷瘤裸鼠血中CEPs含量，从而抑制肿瘤血管形成，产生抗肿瘤效应。

除了抑制肿瘤新生血管生成外，近几年人们逐渐认识到免疫系统在节拍化疗中起到的作用，部分研究证实应用环磷酰胺和紫杉醇节拍化疗方案，较常规的化疗方案其T细胞、淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞等细胞的百分比均有变化，证实了免疫系统起到的作用[3-4]，一些临床实验应用环磷酰胺节拍化疗发现对于肿瘤远处转移和肿瘤侵袭节拍化疗较常规化疗有着更多的优势[9-10]。

卡培他滨是乳腺癌治疗的重要药物，在临床中应用范围较广，但由于常规化疗引起的毒副作用及耐药严重影响了化疗效果，晚期患者及老年患者耐受性更差，无法耐受常规化疗，缺乏有效的治疗手段。在节拍化疗得到研究之后，发现节拍化疗可以通过抑制肿瘤组织中活化的血管内皮细胞和骨髓来源的血管内皮祖细胞、抑制促肿瘤血管生成因子来实现抗肿瘤的作用，同时节拍化疗副反应轻，耐受性好，为晚期患者及耐药患者提供了新的治疗方法[11-12]。

本研究通过在体外应用卡培他滨节拍化疗方案作用于乳腺癌细胞，证明卡培他滨能够抑制乳腺癌细胞的增殖活性，能够抑制乳腺癌细胞的增殖能力，明确了卡培他滨对恶性肿瘤生长的抑制作用。同时节拍化疗组与常规化疗组比较，对乳腺癌肿瘤生长的影响没有区别，可以起到同样的抗肿瘤作用。但根据血液白细胞的检测发现，节拍化疗组的白细胞计数高于常规化疗组，差异有统计学意义，说明在起到同样化疗作用的时候，节拍化疗组的安全性更好，更适用于临床当中身体状态差，不能耐受常规化疗的患者，为他们的继续治疗提供一个良好的化疗方案。在研究中节拍化疗组MVD及VEGF较常规化疗组和对照组降低，TSP-1较常规化疗组和对照组升高，证明了节拍化疗方案对肿瘤血管生成具有抑制作用。同时还通过流式细胞实验研究了免疫系统在节拍化疗中起到的作用，NK细胞及巨噬细胞在节拍化疗组高于常规化疗组，MDSCs细胞低于常规化疗组，说明了免疫细胞比例的改变也是节拍化疗方案能够起到抗肿瘤作用的机制之一。

综上所述，卡培他滨节拍化疗可以起到抗乳腺癌肿瘤的作用，这对于内分泌治疗无效，赫赛汀治疗无效，既往已经应用了常规化疗，但出现了严重不良反应的患者提供了一种新的治疗方案。目前许多研究已经证实了节拍化疗的有效性和可靠性，在以后的乳腺癌临床治疗中，卡培他滨节拍化疗有望成为一种新的常规治疗模式。

1 Border T，Kraling BM.Antiangiogenic scheduling of chemotherapy improves efficacy against experimental drug-resistant cancer[J].Cancer Res，2000，60(7)：1878-1886.

2 Chen X，Zhang JG，Zhao LC，et al.Effects of VEGF-D and VEDFR-3 in breast cancer lymph vessel metastasis[J].Progress in Modern Biomedicine，2006，6(9)：21-23.

3 Shevchenko I，Karakhanova S，Soltek S，et al.Low-dose emcitabine depletes regulatory T cells and improves survival in the orthotopic Panc02 model of pancreatic cancer[J].Int J Cancer，2013，133(1)：98-107.

4 Chen CS，Doloff JC，Waxman DJ.Intermittent metronomic drug schedule is essential for activating antitumor innate immunity and tumor xenograft regression[J].Neoplasia，2014，16(1)：84-96.

5 Shaked Y，Emmengger U，Man S，et al.The optimal biological dose of metronomic chemotherapy regimens is associated with maximum antiangiogenic activity[J].Blood，2005，106(9)：3058-3061.

6 Voloshin T，Voest EE，Shaked Y.The host immunological response to cancer therapy：an emerging concept in tumor biology[J].Exp Cell Res，2013，319(11)：1687-1695.

7 Katz OB，Shaked Y.Host effects contributing to cancer therapy resistance[J].Drug Resist Updat，2015，19：33-42.

8 Shaked Y.Balancing efficacy of and host immune responses to cancer therapy：the yin and yang effects[J].Nat Rev Clin Oncol，2016，13(10)：611-626.

9 Ge Y，Domschke C，Stoiber N，et al.Metronomic cyclophosphamide treatment in metastasized breast cancer patients：immunological effects and clinical outcome[J].Cancer Immunol Immunother，2012，61(3)：353-362.

10 Tongu M，Harashima N，Monma H，et al.Metronomic chemotherapy with low-dose cyclophosphamide plus gemcitabine can induce anti-tumor T cell immunity in vivo[J].Cancer Immunol Immunother，2013，62(2)：383-391.

11 Muthusamy P，Chary KV，Nalini GK.Metronomic chemotherapy：seems prowess to battle against cancer in current scenario[J].J Clin Diagn Res，2016，10(11)：9-13.

12 Rajasekaran T，Ng QS，Tan DS，et al.Metronomic chemotherapy：A relook at its basis and rationale[J].Cancer Lett，2017，388：328-333.

(收稿：2017-03-24)

Rhythmic chemotherapy affects the growth of tumor cells by influencing the formation of blood vessels and the immune system

SHIFeng，YUYan

Department of 6th Internal Medicine，Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China

Objective The objective of this study was to determine the effect of curative chemotherapy regimen on breast cancer cells and its mechanism.Methods A tumor-bearing mouse model was established and routine dose of capecitabine was given as a conventional chemotherapy group.Continuous low-dose capecitabine chemotherapy was used as a radiotherapy group and no chemotherapy was used as a control group.The expression of microvessel density(MVD)，vascular endothelial growth factor(VEGF)and thrombospondin 1(TSP-1)were measured by flow cytometry.The percentage of myeloid-derived suppressor cells(MDSCs)，NK cells and macrophages in the program was observed.The tumor size and blood leukocyte count were measured after chemotherapy.Results MVD and VEGF in the radiotherapy group were significantly decreased and TSP-1 was significantly increased in comparison with the conventional chemotherapy group(P<0.05).The proportion of MDSCs in the radiotherapy group was significantly decreased，the proportion of NK cells and macrophages were significantly increased when compared to the conventional chemotherapy group(P<0.05).The tumor volume was no difference between the control and chemotherapy groups(P>0.05).However，the white blood cell count in the radiotherapy group was significantly higher than that in the conventional chemotherapy group(P<0.05).Conclusion Capecitabine chemotherapy at continuous low-dose inhibits neovascularization and adjusts the proportion of immune cells to suppress tumor formation.Thus，this chemotherapy could reduce side effects caused by chemotherapy and improve the quality of life.

Metronomic chemotherapise；Antiangiogenesis；Immunological system；Quality of life

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内六科(哈尔滨 150081)

石峰，男，(1988-)，硕士，住院医师，从事节拍化疗作用与机制的研究。

于雁，E-mail：yuyan@ems.hrbmu.edu.cn

R737.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.04.006