多梳蛋SUZ12预测吉西他滨治疗肝内胆管癌疗效和预后的研究

刘 楠 韩志阳 鹿芃恬 李丹阳 王英炜 董祥慧 朱 宏

·临床研究·

多梳蛋SUZ12预测吉西他滨治疗肝内胆管癌疗效和预后的研究

刘 楠1韩志阳2鹿芃恬1李丹阳1王英炜1董祥慧1朱 宏1

目的 本研究探讨了肝内胆管癌(ICC)患者多梳蛋白SUZ12的表达及其在预测ICC患者的生存和对治疗反应的作用。方法 用免疫组织化学方法检测207个肝组织样本(包括ICC患者，胆道上皮内瘤样病变患者BilIN-1，-2，-3，和非瘤样病变的胆管样本)SUZ12和p16INK4a蛋白的表达。评估这些蛋白的表达是否和接受化疗的ICC患者的病理学特征和生存结果相关，以及是否和随后的化疗反应相关。结果 从非肿瘤性胆管组织依次到BilIN-1，-2，-3，ICC，SUZ12表达水平渐进增加。而p16INK4a蛋白在非瘤样病变性胆管组织中大量表达，但在BilIN-1，-2，-3，ICC组织中依次逐渐降低。SUZ12表达与未分化的ICC、淋巴结转移和晚期癌症相关。Kaplan-Meier曲线分析显示，高表达SUZ12的ICC患者与低表达SUZ12的ICC患者相比，总生存期和无瘤生存期显著降低。SUZ12表达与接受吉西他滨为基础的辅助化疗(Adjuvant gemcitabine-based chemotherapy，AGC)的患者的总体存活显著相关。结论 SUZ12表达能够预测用吉西他滨为基础的化疗的ICC患者的总生存期和无病生存期。

SUZ12；肝内胆管癌；吉西他滨；p16INK4a

肝内胆管癌(ICC)约占所有原发性肝脏恶性肿瘤的5%～10%[1-2]。在组织学上，正常胆管经过癌前病变发展到ICC遵循着“增生-不典型增生(BilIN-1，-2，-3)-癌”进展模型[2-3]。放化疗是目前治疗ICC的唯一选择，来自几个临床试验的结果表明，使用吉西他滨的术后辅助化疗对晚期胆管癌患者的存活有帮助[4-5]。然而，该辅助化疗的功效存在个体差异，因此，迫切需要有效的评估指标来进行个体化治疗。

最近的研究已经证明，多梳家族(PcG)EZH2增强子和SUZ12通过调节p16INK4a表达参与肿瘤的恶性转化[6-7]，在ICC中，启动子高甲基化是导致p16INK4a基因失活最常见原因[8-9]，因此，本研究分析了SUZ12和p16INK4a蛋白在正常、癌前病变和ICC组织标本中的表达，把SUZ12表达与ICC患者的临床病理和生存的信息相联系，评估ICC患者对化疗的反应。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究选取了哈尔滨医科大学附属第一医院2002年5月—2007年4月手术切除并确诊的112例ICC患者(表1中列出了肿瘤分类、阶段)，根据国际抗癌联盟(UICC)分期系统进行分类，Ⅰ期23例，Ⅱ期17例，Ⅲ期11例，Ⅳ期61例。除去术后死亡患者及术前放射或化疗的患者，共101名患者参与本研究。此外，我们分析了95例肝结石病和11例原发性硬化性胆管炎的组织切片，选择了86例BilIN(79例肝胆管结石和7例原发性硬化性胆管炎)和20例转移性肝肿瘤的非肿瘤部位或创伤性肝断裂的健康肝组织样本。共207例肝组织样本，包括ICC(n=101)，BilIN-3(n=21)，BilIN-2(n=27)，BilIN-1(n=38)和非肿瘤胆管(n=20)用于本研究。

1.2 ICC患者用药方案及随访

肿瘤切除术后AGC的患者有2个选择，静脉和口服联合给药化疗或单独静脉内给化疗药物。静脉和口服联合给药化疗包括第1天静脉注射吉西他滨，剂量为700 mg/m2，然后连续7天口服，剂量为150 mg/m2，每14天重复一个治疗周期。单独静脉内化疗的患者每周两次给予吉西他滨(700 mg/m2)，30 min静脉内输注。101例患者的中位随访时间为21个月(范围1～121个月，起止时间2002年6月—2012年7月)。

1.3 免疫组织化学染色及结果的判定

p16INK4a(克隆EP1511Y)和SUZ12(克隆SUZ220A)的单克隆抗体购自美国Abcam公司。将经福尔马林固定和石蜡包埋的组织切片脱蜡并水化后，用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶30 min。放置组织切片于EDTA缓冲液(pH9)中，在121℃压力锅中煮沸20 min对组织切片进行抗原修复，并用10%马血清孵育30 min阻断非特异性抗体结合，将切片与PBS稀释的抗p16INK4a和SUZ12的抗体(1∶100)在湿盒中4℃孵育过夜，随后，将切片与生物素标记的1∶200稀释的抗小鼠免疫球蛋白在37℃孵育60 min，然后在37℃下与亲和素过氧化物酶结合物在37℃进一步孵育60 min，DAB显色、苏木素复染。使用小鼠IgG代替一抗作为阴性对照。由两个经验丰富的病理学家对切片进行盲审和评分。

对于p16INK4a和SUZ12表达的半定量评估，随机选择四个高倍视野大于200个细胞计算阳性细胞的百分比，并且将平均值视为每个病变的标记指数(LI)。SUZ12表达记为阴性(评分1，无染色)，弱(评分2；LI小于25%)，中度(评分3；LI为25%至75%)和强(评分4；LI大于75%)。分数1和2被认为是SUZ12低表达，而分数3和4被认为是SUZ12高表达。

1.4 统计分析

使用SPSS 18.0统计软件分析数据，采用Pearson相关分析法分析SUZ12及p16INK4a蛋白之间的相关性，采用方差分析法分析BilIN-1，-2，-3和ICC之间SUZ12及p16INK4a蛋白表达差异；使用卡方检验分析SUZ12表达与各临床病理学参数的关系。使用Kaplan-Meier方法构建生存曲线，并通过Log-rank检验比较生存曲线的差异，使用Cox比例风险模型对单因素分析有统计学意义的变量进行多因素分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BilIN和ICC患者中SUZ12和p16INK4a蛋白的差异表达

SUZ12表达水平依次从非肿瘤性胆管组织，BilIN-1，-2，-3到ICC成渐进性增加，而p16INK4a蛋白的表达从非肿瘤性胆管细胞，BilIN-1，-2，-3和ICC成渐进性减少(P<0.001，图1C和B)。SUZ12表达的标记指数在BilIN-1中为(11.07±9.77)%，在BilIN-2中为(26.03±13.51)%，在BilIN-3中为(39.71±22.29)%，在ICC中为(49.74±27.84)%。p16INK4a表达的标记指数在BilIN-1中为(45.84±15.63)%，在BilIN-2中为(32.19±14.07)%，在BilIN-3中为(27.90±22.71)%，在ICC中为(16.55±11.20)%(P<0.001；图2A和B)。因此，SUZ12和p16INK4a的表达在这些组织标本中呈负相关(r=-0.721，P<0.001；图2C)。

2.2 ICC患者中SUZ12表达与临床病理特征之间的关系

SUZ12表达在分化不良的肿瘤中表达率高于在晚期或中度分化的肿瘤(84%vs. 35%)；在淋巴结转移病例表达高于未转移病例(80%vs. 42%)；SUZ12在pT3和T4中的表达显著高于pT1和T2肿瘤(78%vs. 41%)。在Ⅲ和Ⅳ期ICC患者中表达高于Ⅰ和Ⅱ期患者(78%vs. 39%)(P<0.05；表1)。

2.4 SUZ12表达与患者生存的相关性

本研究ICC患者，1年的总生存率为78%，3年为33%，5年为13%。Kaplan-Meier曲线分析显示，SUZ12表达与这些患者的总生存期和无瘤生存期相关(图3)，单因素分析显示残余肿瘤(P<0.001)，病理分化(P<0.001)，淋巴淋结转移(P<0.001)，pT分期(P<0.001)，临床分期(P<0.001)，SUZ12表达(P=0.049)与总生存期显著相关，而AGC治疗与患者总生存期无关(P=0.155)。接受AGC治疗的患者的5年存活率为16.36%，相比之下，未接受治疗的患者分别为10.87%(表2)。多变量分析显示对于ICC患者，肿瘤分化(HR=6.22；95%CI：2.91～13.33；P<0.001)和残留肿瘤(HR=5.29；95%CI：2.82～9.90；P<0.001)是独立预后因素(表2)。

图1 SUZ12和p16INK4a蛋白在207个肝组织标本中的表达(放大倍率 400×)Figure 1 The expression of SUZ12 and p16INK4a proteins in 207 cases of liver tissue specimens(Magnification 400×)

FactorUnivariateanalysisNo．patients(survival)5-yearsurvivalrate(%)PMultivariateanalysisHR(95%CI)PAge(yrs．)0．113<7051(31)6．08≥7050(10)20．00Gender0．285Male59(6)10．17Female42(7)16．67Useofgemcitabine0．155Yes55(9)16．36No46(5)10．87Residualtumor<0．0015．29(2．82～9．90)<0．001R065(2)3．07R136(0)0．00Tumordifferentiation<0．0016．22(2．91-13．33)<0．001Well/moderately43(10)23．26Poorly58(0)0．00Lymphnodemetastasis<0．001No45(10)22．22Yes56(22)3．93UICCpTstage<0．001T1，241(11)26．83T3，460(0)0．00UICCclinicalstage<0．001Ⅰ，Ⅱ38(9)23．68Ⅲ，Ⅳ63(1)1．59SUZ12expression0．049Low37(7)18．92High64(5)7．81

2.5 接受AGC治疗的ICC患者中SUZ12表达的预后意义

对于接受AGC治疗的55名患者，SUZ12表达与总生存率显著相关(P=0.031)。SUZ12高表达患者的1年、3年和5年生存率分别为82%、32%和5%，SUZ12低表达的患者为90%、45%和28%(图4A)。然而，在没有AGC治疗的患者中，SUZ12高表达和低表达患者之间没有显著的生存差异(P=0.558)。在没有AGC治疗的患者中，SUZ12高表达的肿瘤患者的1年、3年和5年生存率分别为68%、22%和11%，而SUZ12低表达的肿瘤患者为70%、39%和8%(图4B)。

此外，在低SUZ12表达的ICC的患者中(n=37)，AGC治疗后的总生存显著好于没有AGC治疗的患者(P=0.048，图5A)，而在高表达SUZ12的肿瘤患者中(n=64)，有和没有AGC治疗的患者的总生存率没有显著差异(P=0.641，图5B)。

图2 BilIN-1，-2，-3和ICC中p16INK4a和SUZ12表达的免疫组织化学结果的半定量分析Figure 2 Semi-quantitative evaluation of p16INK4a and SUZ12 expression in BilIN-1，-2，-3 and ICC by immunohistochemistryNote：# P<0.05

图4 不同SUZ12分组ICC患者的Kaplan-Meier曲线Figure 4 Kaplan-Meier curves of ICC patients stratified by SUZ12 expressionNote：A.Overall survival of patients with adjuvant gemcitabine-based chemotherapy(AGC)(n=55)；B.Overall survival of patients without AGC(n=46).

图3 不同SUZ12分组ICC患者的Kaplan-Meier曲线(n=101)Figure 3 Kaplan-Meier curves of ICC patients stratified by SUZ12 expression(n=101)Note：A.overall survival；B.disease free survival；C.Overall survival vs.and disease-free survival.

图5 不同AGC分组ICC患者的Kaplan-Meier曲线Figure 5 Kaplan-Meier curves of patients stratified by AGCNote：A.ICC patients with SUZ12-expressed tumor(n=64)；B.patients with low SUZ12-expressed tumor(n=37).Gem(+).patients treated with AGC；Gem(-).patients who did not received AGC.

3 讨论

本研究数据表明从非肿瘤性胆管，BilIN-1，-2，-3，到ICC组织标本，SUZ12表达渐进性增加，而p16INK4a表达在这些组织标本中减少。该发现进一步证实了ICC和ICC风险性疾病的“正常-增生-癌前病变-癌”进展模型，表明SUZ12表达可以进一步被认为是ICC诊断或预测肿瘤发生的标志物。此外，我们还发现SUZ12的表达与未分化的ICC、淋巴结转移和晚期癌症相关。异常的SUZ12表达与ICC总体生存和无瘤生存不良有关，也和吉西他滨为基础的辅助化疗的反应有关。

最近的研究显示在其他类型癌症中异常的SUZ12表达与攻击性增强相关[10-11]。例如，Kirmizis等[10]报道了SUZ12 mRNA在结肠癌、乳腺癌和肝癌中上调，并且提议SUZ12作为人癌症治疗的潜在分子靶点。已显示SUZ12蛋白的消耗导致胃癌细胞增殖的抑制[11]。在本研究中，我们评估非肿瘤性胆管，BilIN-1，-2，-3和ICC组织标本中的SUZ12表达，发现在ICC发展过程中SUZ12表达逐渐增加，而p16INK4a蛋白在这些组织中逐渐丧失。这些数据进一步证实了以前对ICC中p16INK4a蛋白的研究[12-13]。而且，本研究结果提示SUZ12表达与ICC患者的生存相关。此外，本研究结果证明接受AGC的患者具有比未接受这种治疗的患者有更高的存活率，而AGC治疗不显著促进或延长具有高表达SUZ12患者的总体存活。相比之下，在ICC中低表达SUZ12和接受AGC的患者比在ICC中具有SUZ12高表达并且接受AGC的那些患者具有显著更好的存活。然而，在没有接受AGC的患者中，SUZ12表达和总生存之间没有显著的相关性。

此外，本研究中的多因素分析表明，SUZ12表达不是ICC患者预后的独立预测因子，这可能是由于SUZ12表达与未分化ICC，淋巴结转移和晚期ICC分期的强关联。这些是与大多数恶性肿瘤的不良预后相关的已知因素。然而，我们不能排除当未来的研究中使用大样本量时，SUZ12表达可以提供独立的预后信息。本研究的其他主要局限性在于，它不是前瞻性研究，也不是随机临床试验。因此，需要使用更大样本量的前瞻性研究来确认SUZ12作为ICC的生物标志物的预测价值。

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Expression of polycomb protein SUZ12 predicts poor prognosis and response of patients with intrahepatic cholangiocarcinoma to adjuvant gemcitabine-based chemotherapy

LIUNan1，HANZhiyang2，LUPengtian1，LIDanyang1，WANGYingwei1，DONGXianghui1，ZHUHong1

1.Department of Pathology，The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，China； 2.Department of General Surgery，The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University

Objective This study explored the expression of polyclonal protein SUZ12 in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma(ICC)，and its role in predicting the survival and treatment of ICC patients.Methods The expression of SUZ12 and p16INK4awas detected by immunohistochemical assay in 207 liver tissue samples including ICC patients，BilIN-1，-2，-3 and non-tumor-like cholangiocarcinoma.The expression of these proteins was assessed to be related to the pathological characteristics of the ICC patients receiving chemotherapy and the outcome of survival as well as the subsequent chemotherapy response.Results The expression level of SUZ12 was gradually increased from non-neoplastic bile duct tissue to BilIN-1，-2，-3 and ICC.The expression of p16INK4aprotein was expressed in non-neoplastic-like cholangiocarcinoma，but it decreased gradually in BilIN-1，-2，-3 and ICC tissues.SUZ12 expression was associated with undifferentiated ICC，lymph node metastasis and advanced cancer.Kaplan-Meier curve analysis showed that ICC patients with high expression of SUZ12 had a significant reduction in overall survival and disease-free survival in comparison with ICC patients with the low expression of SUZ12.SUZ12 expression was significantly associated with overall survival of patients receiving adjuvant gemcitabine-based chemotherapy(AGC).Conclusion SUZ12 expression is able to predict the overall survival and disease-free survival of ICC patients with adjuvant gemcitabine-based chemotherapy.

SUZ12；Intrahepatic cholangiocarcinoma；Gemcitabine；p16INK4a

黑龙江省自然科学基金项目(H201445)

1.哈尔滨医科大学附属第一医院病理科(哈尔滨 150001)；2.哈尔滨医科大学附属第一医院普外科

刘楠，女，(1981-)，博士，主治医师，从事肿瘤发病机制及预后的研究。

朱宏，E-mail：252302504@qq.com

R322.4

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.04.007