不同艾灸预处理时间对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3表达的影响

王超，刘薇薇，黄洁，刘密，谭成富，常小荣，严洁

(1.湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007)

针 灸 经 络

不同艾灸预处理时间对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3表达的影响

王超1，刘薇薇1，黄洁2*，刘密1，谭成富1，常小荣1，严洁1

(1.湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007)

目的：通过观察不同艾灸预处理时间对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3) 蛋白和基因表达的变化，探讨艾灸预处理对MIRI预防保护机制。方法：将40只大鼠分为正常组、模型组、艾灸预处理5天组、艾灸预处理10天组。取“内关”穴行艾灸预处理5 d和10 d后，采用冠脉结扎法建立MIRI模型。运用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术以及Western blot方法检测大鼠心肌细胞中Bcl-2、HIF-1α及Caspase-3蛋白及基因表达。结果：与正常组比较，模型组HIF-1α和Caspase-3蛋白及mRNA表达均高于正常水平(P<0.01)，Bcl-2蛋白及mRNA表达低于正常水平(P<0.01)。与模型组比较，艾灸预处理组HIF-1α蛋白及mRNA表达降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白及mRNA表达增高(P<0.01)，Caspase-3蛋白及mRNA表达下降(P<0.01 orP<0.05)。与5天组比较，艾灸预处理10天组HIF-1α mRNA表达明显降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白显著增高(P<0.05)，Caspase-3蛋白及mRNA表达显著下降(P<0.01)。结论：艾灸预处理可通过降低MIRI大鼠心肌细胞中HIF-1α、Caspase-3的含量，增加心肌细胞中Bcl-2的含量，改善心肌缺血缺氧状态以及抑制心肌细胞凋亡，对损伤心肌细胞起到预防保护作用。其中艾灸预处理10天对心肌细胞保护作用优于5天。

艾灸预处理；心肌缺血再灌注损伤；低氧诱导因子-1α；B细胞淋巴瘤/白血病-2；天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3

冠心病已成为全球范围内高致病率和高死亡率的疾病之一[1]。目前临床上主要通过药物、介入、外科手术等手段来改善冠状动脉血供、降低心肌耗氧量。然而各种血运重建手段的运用，在恢复心肌供血供氧同时可导致心肌细胞的损伤甚至坏死，称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)[2-3]。本课题组前期动物实验证实，针灸预处理对MIRI造成的缺血心肌具有良好的保护作用[4-6]。与针刺比较，艾灸更安全，且易被患者接受的。本实验旨在观察不同艾灸预处理时间对MIRI大鼠心肌细胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3蛋白和基因表达的变化，探讨艾灸预处理对MIRI心肌细胞的保护是否与这三者有关，同时明确不同艾灸预处理时间是否对心肌细胞作用结果存在差异。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量(220±10)g，由湖南中医药大学动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK(湘)2011-0003。饲养温度22～25℃，湿度40%～60%。适应性喂养1周，随机分为4组，正常组、模型组、艾灸预处理5天组、艾灸预处理10天组。实验程序经湖南中医药大学实验动物中心动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

水合氯醛(上海山浦化工有限公司)；生理盐水(双鹤药业)；逆转录试剂盒(Fermentas)；Trizol(Invitrogen)。

ALC-V108动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)；ECG-9620P三道自动分析心电图机(上海光电医用电子仪器有限公司)；艾条(南阳汉医艾绒有限责任公司，豫卫健用字[2004]第N0248号，规格：4 mm×120 mm×90支)；自制简易艾灸架；TS-92摇床(其林贝尔)；TGL-18R台式冷冻离心机(深圳黑马)；164-5050电泳仪(Bio-rad)；PIKO REAL 96荧光定量RCP仪(Thermo)。

1.3 造模方法

模型组、艾灸预处理5天组及艾灸预处理10天组大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100g)全身麻醉，将其仰卧位固定于鼠板之上，术前大鼠胸前区去毛，碘伏消毒，开胸沿左侧第四、五肋骨间剪开，轻轻剪破心包膜，提起左心耳，在冠状动脉左前降支1/3处穿0号线，置一硅胶管结扎，以心电图ST段的改变及冠脉向外膨胀发绀为结扎成功标志，结扎40 min后，剪开硅胶管恢复左前降支灌流60 min。

1.4 穴位定位和处理方法

穴位定位参考常用动物穴位定位[7]，内关穴位于前肢内侧离腕关节约3 mm左右的尺桡骨缝间。

正常组和模型组大鼠每天捆绑束缚20 min，连续5 d；艾灸预处理5天组大鼠每天捆绑固定于鼠板上，将艾条点燃后固定于自制灸架上，燃烧端分别对准大鼠双侧内关穴，距离约0.5 cm左右，内关穴局部温度控制在(42±1)℃(随着艾条的燃烧及时弹去灰烬并调整距离)，每次20 min，1次/d，共5 d；艾灸预处理10天组同样固定、取穴、施灸，每次20 min，1次/d，共10 d。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 Western blot检测

检测大鼠心肌细胞中Bcl-2、HIF-1α及Caspase-3蛋白。剪取0.25 g心肌组织缓冲液洗净后反复研磨，冰上蛋白裂解30 min，离心后取上清(即为组织蛋白)。按照BCA蛋白定量试剂盒(Wellbio)测定蛋白浓度。吸取蛋白组织与5×loading buffer混匀，沸水煮5 min制备电泳样本，根据蛋白定量结果进行SDS-PAGE稳压电泳(浓缩胶电泳电压为80 V，分离胶电泳电压为120 V)。待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。将PVDF膜与滤纸依次排列置于转膜缓冲液中完全浸透，将胶上的蛋白转移至PVDF膜(HIF-1α约2 h，Bcl-2约30 min， Caspase-3约40 min)。将膜取出漂洗后，按一定稀释比例(HIF-1α∶1∶200；Bcl-2∶1∶500；Caspase-3∶1∶1000)与对应抗体进行一抗孵育，与HRP标记的二抗(稀释比例1∶3000)进行二抗孵育。使用ECL化学发光液显色曝光，显影冲洗。

1.5.2 RT-PCR检测

检测心肌细胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3基因的相对表达。取心肌组织约0.02 g加入1 mL Trizol研磨匀浆，加三氯甲烷震荡，离心加等体积的异丙醇静置。低温离心后弃上清保留白色沉淀，加乙醇震荡。低温离心弃上清加无菌无酶水溶解沉淀。吸取2μL RNA溶液运用紫外分光光度计测定在260 nm与280 nm处吸光度值，计算其浓度跟纯度。经过逆转录cDNA，PCR扩增反应(actin为内参，引物序列及扩增长度见表1)，读取Ct(cycle threshold)值，采用2-△△Ct值反映各样品相对于对照组样品目的基因的表达水平，重复3次独立实验，得到均值。

表1 引物序列及扩增长度

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 艾灸预处理对MIRI大鼠心肌细胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3蛋白影响

结果见表2。与正常组比较，模型组大鼠心肌细胞中Bcl-2的蛋白表达明显降低(P<0.01)，HIF-1α及Caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，艾灸预处理5天组与艾灸预处理10天组大鼠心肌细胞中Bcl-2的蛋白表达显著升高(P<0.01)，HIF-1α及Caspase-3蛋白表达明显降低(P<0.01)；与艾灸预处理5天组比较，艾灸预处理10天组大鼠Bcl-2的蛋白表达显著升高(P<0.05)，Caspase-3的蛋白表达显著降低(P<0.01)，而心肌细胞中HIF-1α的蛋白表达未见明显差异(P>0.05)。

2.2 艾灸预处理组对MIRI大鼠心肌细胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3基因的相对表达

结果见表3。与正常组比较，模型组大鼠心肌细胞中Bcl-2 mRNA含量明显降低(P<0.01)，HIF-1α及Caspase-3 mRNA含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，艾灸预处理5天组与艾灸预处理10天组大鼠心肌细胞中Bcl-2 mRNA含量显著升高(P<0.01)，HIF-1α及Caspase-3 mRNA含量明显降低(P<0.01 orP<0.05)；与艾灸预处理5天组比较，艾灸预处理10天组大鼠HIF-1α mRNA含量及Caspase-3 mRNA含量显著降低(P<0.05)，而心肌细胞中Bcl-2 mRNA含量未见明显差异(P>0.05)。

表2 各组心肌细胞HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3蛋白表达的比较

注：与正常组比较,*P<0.01;与模型组比较，▲P<0.01;与艾灸预处理5天组比较,●P<0.05,●●P<0.01

表3 各组心肌细胞HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3 mRNA含量比较

注：与正常组比较,*P<0.01;与模型组比较，▲P<0.01,P<0.05;与艾灸预处理5天组比较，●P<0.05,●●P<0.01

3 讨论

HIF-1α是维持体内氧稳态平衡调节的核转录因子，心肌组织在缺血缺氧条件下可应激性的引起HIF-1α表达大量增加，在缺血的心肌组织中高表达HIF-1α会进一步激活细胞膜上的酸敏感离子通道，从而进一步破坏心肌细胞[8]。MIRI过程中最主要的分子生物变化表现为心肌细胞的大量凋亡，Bcl-2家族蛋白就是一类在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白质，其中Bcl-2为抗凋亡蛋白，其机制主要是通过抑制Caspase蛋白酶活性从而抑制细胞凋亡。一般情况下，当细胞受到损伤或者细胞凋亡时，Bcl-2基因表达则显著下降。Caspase-3是参与细胞凋亡启动与执行的Caspase家族中最关键的凋亡蛋白酶，动物实验证实[9]，由Caspase-3介导的心肌细胞凋亡是MIRI发生的重要机制。本研究结果显示，与正常组大鼠比较，模型组大鼠心肌细胞内HIF-1α和Caspase-3蛋白及mRNA表达均高于正常水平，Bcl-2蛋白及mRNA表达均低于正常水平，皆提示本实验所采用的造模方法能使大鼠造成MIRI模型，引起大鼠心肌缺血缺氧，造成实验大鼠心肌损伤，使大鼠心肌细胞凋亡。

中医学历来注重对疾病的预防，早在《内经》中已提出“不治已病治未病”。针灸“治未病”古称“逆针灸”，即无病而施用针灸，以疏通经络气血，调节脏腑阴阳，以增强人体抗病能力。近年来针灸界提出的“针灸预处理”，与“逆针灸”有着相似之处。李晓泓[10]发现针灸“治未病”与现代医学应激理论有一定的联系，即机体通过采取一定物理或者化学预处理方法激发机体出现适度应激从而达到激发机体抗病能力的目的，这一特点与针灸预处理理论不谋而合。临床上MIRI产生机制尚未明确，对其防治手段包括缺血预适应(ischemic preconditioning，IP)、缺血后处理、远程缺血预适应、药物治疗等[11]，其中心肌缺血预适应(IP)作为目前最有效的内源性保护机制，是指心肌在遭受反复短暂缺血后对缺血再灌注损伤的耐受力增强，能显著缩小心肌梗死面积、减轻心肌细胞超微结构损伤[12]，对心肌细胞能起到明显的保护作用。课题组前期实验证实[4-6],针灸预处理能取得与心肌缺血预适应相似的效果。

艾灸预处理与针刺预处理重视既病防传的特点比较，更加注重于未病先防[13]。现代研究[14]证实艾灸存在药物作用、温热作用与近红外光辐射作用3大主要机制，其中温热作用引起的临床效应称之为温补效应、温通效应[15]。温热作用是产生灸效的主要因素，其中决定灸效的关键是灸量，而构成有效灸量的核心在于灸时。与用药累积量同理，施灸时间越长能释放更多被机体吸收的能量和化学物质[16]。中医学中尚提及“心肌缺血再灌注损伤”这一病名，结合临床表现将其归于“胸痹”“心痛”范畴[17-18]。病性总属本虚标实，故辨证论治不外乎“补”“通”两义。艾灸预处理治疗MIRI取之艾灸温补温通作用中“补虚固本”“通脉散瘀”之义。内关穴属心包经之络穴，外邪侵心治之以心包络，取“代君受邪”之义。又为八脉交会穴，通阴维脉，为治疗心胸疾病之首选穴位[19-20]。课题组前期实验皆已经证实[3-5],针灸预处理“内关”穴对心肌细胞存在有保护作用。

本实验结果显示，与模型组比较，两组艾灸预处理大鼠心肌细胞中HIF-1α蛋白及mRNA表达降低，提示艾灸预处理能降低HIF-1α浓度，改善心肌缺血、缺氧状态。Bcl-2蛋白及mRNA表达增高，Caspase-3蛋白及mRNA表达均下调，提示艾灸预处理通过增加Bcl-2浓度，抑制Caspase-3蛋白酶活性，从而缓解MIRI引起的心肌细胞凋亡。与艾灸预处理5天组比较，艾灸预处理10天组HIF-1α mRNA表达显著降低，提示10天组能更有效的缓解心肌缺血缺氧状态。比较艾灸预处理5天组，Bcl-2蛋白显著增高，Caspase-3蛋白及mRNA表达明显降低，提示艾灸预处理10天组通过进一步高表达Bcl-2更有效的阻断Caspase-3凋亡蛋白酶的激活，从而抑制细胞凋亡。

综上所述，艾灸内关能显著改善心肌缺血缺氧状态以及抑制心肌细胞凋亡。随着对心肌缺血发病机制的不断深入研究，艾灸对于防治心肌缺血有巨大的学术研究空间和临床运用价值。但不同艾灸预处理时间对心肌缺血疗效中存在差异，与施灸时间和有效灸量有关，但其作用机制尚未明确，有待课题组进一步研究。

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Effect of Different Length of Moxibustion Preconditioning on the Expression of HIF-1α, Bcl-2 and Caspase-3 in Myocardial Cells of MIRI Rats

WANG Chao1, LIU Wei-wei1, HUANG Jie2, LIU Mi1, TAN Cheng-fu1, CHANG Xiao-rong1, YAN Jie1

(1.AcupunctureandMassageCollegeofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China;2.TheFirstAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410007,China)

Objective: To discuss the protective mechanism of moxibustion preconditioning for myocardial ischemia reperfusion injury(MIRI), by observing the expression changes of HIF-1α, Bcl-2, and Caspase-3 protein and mRNA in myocardial cells of MIRI rats by different length of moxibustion preconditioning. Methods: 40 rats were randomly divided into the normal group, the model group, the moxibustion preconditioning group A(preconditioning for 5 days), and moxibustion preconditioning group B(preconditioning for 10 days). Moxibustion preconditioning was applied on point of PC6 for 5 or 10 days respectively before MIRI model being established by coronary artery ligation. The expressions of HIF-1α, and Caspase-3 protein and mRNA in myocardial cells were detected with RT-PCR technique and Western blot method. Results: The protein and mRNA expressions of HIF-1α, and Caspase-3 in the model group was higher than the normal level(P<0.01); the protein and mRNA expressions of Bcl-2 in the model group was lower than the normal level (P<0.01). Compared to the model group, the expressions of HIF-1α and Caspase-3 in the moxibustion preconditioning groups decreased significantly(P<0.05,P<0.01), the expressions of Bcl-2 increased significantly(P<0.01), of which moxibustion preconditioning group B was superior to group A(P<0.05,P<0.01). Conclusion: Moxibustion preconditioning can decrease the expression of HIF-1α and Caspase-3 and increase the expression of Bcl-2 in myocardial cells to improve myocardial ischemia and inhibit myocardial apoptosis. The protective effect of moxibustion preconditioning for 10 days was better than that for 5 days.

Moxibustion preconditioning; Myocardial ischemia reperfusion injury; HIF-1α; Bcl-2; Caspase-3

2016-09-12

2017-02-20

2015年针灸推拿学湖南省“十二五”重点学科开放基金资助项目(06)；国家自然科学基金项目(81574080)；湖南省中管局课题(201521)；湖南省高校创新平台开放基金项目(15k093)

王超(1974-)，女，硕士，副教授，硕士研究生导师，研究方向：经脉脏腑相关机制的研究。

*通讯作者：黄洁(1969-)，女，硕士，副主任医师，硕士研究生导师,研究方向：经脉脏腑相关机制的研究。

R245;R285.5

A

1002-2392(2017)04-0070-04