芍药苷对Aβ1-42诱导的小胶质细胞炎性反应和趋化性的影响

刘华岩 王军

芍药苷对Aβ1-42诱导的小胶质细胞炎性反应和趋化性的影响

刘华岩 王军

目的 探讨芍药苷(PF)对β-淀粉样蛋白(Aβ)1-42诱导的小胶质细胞炎性反应和趋化性的影响。方法 原代培养大鼠小胶质细胞，分别用0、5、25、50 μmol/LPF预处理细胞后，采用CCK-8法和LDH法检测细胞毒性。将培养的细胞分为空白对照组(正常培养基)、阳性对照组(Aβ1-42处理细胞)和实验组(PF+Aβ1-42处理细胞)。采用ELISA法检测各组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和趋化因子配体1(CXCL1)、趋化因子配体2(CCL2)的表达水平。采用Transwell小室进行小胶质细胞体外趋化实验，观察各组细胞趋化迁移情况。结论 培养大鼠原代小胶质细胞纯度达90%以上，CCK-8法和LDH法测定均显示PF对小胶质细胞无明显细胞毒作用(均P>0.05)。PF可抑制Aβ1-42诱导的小胶质细胞分泌促炎性介质TNF-α、IL-1β、IL-6和趋化因子CXCL1、CCL2(均P<0.01)。同时，PF可抑制小胶质细胞向Aβ1-42的趋化(均P<0.05)。结论 PF可抑制Aβ1-42诱导的啮齿动物小胶质细胞生成促炎性介质和趋化因子，并抑制小胶质细胞向Aβ1-42趋化迁移，提示PF可能为阿尔茨海默病的治疗提供新的契机。

阿尔茨海默病；β-淀粉样蛋白；小胶质细胞；炎症；趋化

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种常见的神经退行性疾病，主要以记忆力下降等认知功能障碍为特点。AD主要病理机制为脑内β-淀粉样蛋白(beta-amyloid，Aβ)沉积。小胶质细胞在AD的发展中具有双重作用[1]。防止Aβ介导的小胶质细胞的过度活化和迁移已被认为是延缓AD进展的潜在手段。芍药苷(paeoniflorin，PF)是一种水溶性单萜苷[2]，具有抗炎和抗氧化能力且无明显不良反应及毒性作用[3]。研究证实PF在脑缺血及神经退行性疾病中具有神经保护作用。目前有关PF对Aβ刺激下小胶质细胞的炎性反应和趋化性的作用知之甚少。本研究采用体外实验Aβ1-42刺激小胶质细胞模拟AD环境，旨在探讨PF对Aβ1-42刺激小胶质细胞炎性反应和趋化性的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 新出生当天SD大鼠，雌雄不限，体重约8 g，由中国医科大学动物部提供。

1.2 主要仪器及试剂 包括共聚焦显微镜(OLYMPUS公司)、倒置相差显微镜(厦门麦克奥迪医疗诊断系统有限公司)、酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)、CO2培养箱(上海力申科学仪器有限公司)、DMEM培养基(Gibco公司)、PF(大连美仑生物技术有限公司)、Aβ1-42(北京博奥森生物公司)、CD11b抗体(Abcam公司)、CCK-8试剂盒(碧云天生物技术有限公司)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)、ELISA试剂盒(USCN公司、Boster公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠原代小胶质细胞的分离培养：参照文献方法[4]分离培养原代小胶质细胞。将新生SD大鼠脑组织剪碎后用0.25%(质量浓度)胰酶消化30 min，利用DMEM培养基(含10% FBS)置于5%(体积分数)CO2、37℃培养箱进行培养。细胞生长至第5天时，密度可达70%，进行固定，并鉴定纯度。第一代细胞生长至5～6 d时，进行传代处理。加入胰酶消化细胞后，轻轻摇晃培养瓶，收集小胶质细胞继续培养。纯度鉴定：将细胞固定于4%(质量浓度)多聚甲醛中15 min。PBS洗3次后，滴加0.1%(质量浓度)TritonX-100室温孵育30 min。PBS洗3次后，滴加山羊血清室温15 min。滴加抗体CD11b(1∶50稀释)，4℃过夜。PBS洗3次后，滴加Cy3标记二抗(1∶200稀释)，室温60 min。PBS洗3次后，滴加DAPI以复染细胞核。PBS洗3次后，滴加抗荧光淬灭剂，封片，于激光共聚焦显微镜下观察，400倍镜下拍照。

1.3.2 细胞毒性检测：(1)PF的配制：称取4.8 mg的PF粉末完全溶解于1 mL DMSO中，其浓度为0.01 mol/L，置4℃冰箱备用。因PF处理不同类型细胞所需浓度差异很大[5-6]，故本研究用不同浓度PF处理小胶质细胞，以优化PF的实验浓度。(2)CCK-8法细胞毒性检测：将细胞接种于96孔培养板中，每孔2×103个细胞，每组设5个复孔，分为4组，分别用0、5、25、50 μmol/LPF处理细胞24h，加入10 μmol/L CCK-8溶液继续培养1 h，利用酶标仪测定其450 nm下吸光度〔D(λ)450 nm〕值。(3)LDH法细胞毒性检测：按上述步骤(2)方法接种细胞、分组以及PE处理细胞24 h，离心留取上清，按照试剂盒说明加样，混匀后37℃水浴15 min。加入2,4-二硝基苯肼，混匀后再置37℃水浴15 min。加入0.4 mol/L NaOH溶液，混匀后室温放置5 min。利用酶标仪检测其D(λ)450 nm值。

1.3.3 纤维化Aβ的制备及分组：将Aβ1-42肽首先充分溶于DMSO，浓度为10 mmol/L，混匀，加入DPBS，终浓度为250 μmol/L，充分混匀。置于37℃温箱中孵育1周，以充分形成纤维化。使用前用培养液稀释成10 μmol/L。分为3组：空白对照组(正常培养基)、阳性对照组(Aβ1-42组：10 μmol/L Aβ1-42处理细胞24 h)和实验组(PF+Aβ1-42组：50 μmol/L PF处理细胞24 h，然后10 μmol/L Aβ1-42处理细胞24 h)。

1.3.4 细胞因子和趋化因子检测：采用ELISA法分别检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、趋化因子配体1(chemokineC-X-C motifligand 1，CXCL1)和趋化因子配体2(chemokineC-C motifligand 2，CCL2)。以TNF-α检测为例介绍操作过程。

检测前将所有试剂和标本缓慢均衡至室温，按照说明书准备标准品、检测稀释液A和B、检测溶液A和B、浓洗涤液和底物溶液。操作步骤：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100 μL不同浓度标准品，空白孔加入100 μL标准品稀释液，余孔加入稀释后的待测样品100 μL，酶标板加上覆膜，37℃温育2 h。弃去液体，甩干。每孔加检测溶液A工作液100 μL，酶标板加上覆膜，37℃温育1 h。弃去孔内液体，每孔用350 μL的洗涤液洗涤，浸泡2 min，吸除酶标板内的液体，重复洗板3次。每孔加检测溶液B工作液100 μL，加上覆膜，37℃温育30 min。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每孔加底物溶液90 μL，酶标板加上覆膜，37℃避光显色。每孔加入终止溶液50 μL终止反应，此时蓝色立转黄色。立即用酶标仪检测各孔D(λ)450 nm值，取各复孔平均值，使用Curve expert 1.3软件进行分析，制作标准曲线并计算各待测样品细胞因子及趋化因子水平。

1.3.5 小胶质细胞体外趋化实验：用Transwell小室(孔径8 μm)进行体外实验。选用对数生长期细胞，弃培养基，用PBS洗3次，胰酶消化，待细胞将要从培养瓶壁脱落时，倒去多余的胰酶。加入无血清培养基，将细胞从培养瓶壁上吹落并分散成单细胞悬液。进行细胞计数，并稀释成1×105个/mL的细胞悬液备用。将Transwell小室放入24孔板中，分为3组：空白对照组(Control组：下室为正常培养基)、阳性对照组(Aβ1-42组：下室为用10 μmol/L Aβ1-42培养细胞24 h后的培养基)和实验组(PF+Aβ1-42组：50 μmol/L PF处理细胞24 h后，细胞移至上室，下室为用10 μmol/L Aβ1-42培养细胞24 h后的培养基)。分别取细胞悬液200 μL加入上室，细胞数均为5×104个/孔，置于培养箱培养24 h。取出Transwell小室，用PBS上下各冲洗1次；用棉签擦去微孔膜上层细胞；多聚甲醛室温下固定20 min，苏木素染液染色5 min，蒸馏水冲洗。在200倍倒置显微镜下对迁移至微孔膜下层的细胞计数。每个样本选取5个视野计数细胞，取均数。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠原代小胶质细胞纯度鉴定 正常状态下小胶质细胞多为静息状态，贴壁生长，呈长形或三角形，胞体小，核小而致密，胞质少，突起细长而呈高度分枝状(图1A)。用CD11b/DAPI免疫荧光染色可见小胶质细胞纯度达90%以上(图1B)。

图1 大鼠原代小胶质细胞形态(A，倒置相差显微镜)与纯度鉴定〔B，免疫荧光染色，CD11b阳性(红染)为小胶质细胞，DAPI(蓝染)为细胞核复染〕

2.2 PF对小胶质细胞细胞毒性影响 CCK-8法和LDH法测定结果均显示，5、25、50 μmol/L PF预处理组D(λ)450 nm值与0 μmol/L PF组比较均无统计学差异(FCCK-8法=0.29，P>0.05；FLDH法=1.38，P>0.05)，表明即使是在50 μmol/L高浓度情况下，PF对原代小胶质细胞亦无明显细胞毒作用。本文选择50 μmol/L进行后续实验。具体结果见图2。

注：A：CCK-8法；B：LDH法；PF：芍药苷，图3、4、6同 图2 不同PF浓度对小胶质细胞活力的影响(n=5)

2.3 PF抑制Aβ1-42引起的小胶质细胞分泌促炎性介质 空白对照组、Aβ1-42组和PF+Aβ1-42组间比较，TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平均有统计学差异(FTNF-α=82.34，P<0.01；FIL-1β=44.86，P<0.01；FIL-6=39.42，P<0.01)。两两比较，Aβ1-42组小胶质细胞表达的促炎性细胞因子较空白对照组增多(均P<0.01)，而PF可部分抑制由Aβ1-42引起的TNF-α、IL-1β和IL-6分泌增多(均P<0.01)。结果见图3。

2.4 PF抑制Aβ1-42诱导的小胶质细胞分泌趋化因子 空白对照组、Aβ1-42组和PF+Aβ1-42组小胶质细胞分泌的CXCL1和CCL2比较差异有统计学意义(FCXCL1=81.84，P<0.01；FCCL2=68.45，P<0.01)。两两比较，Aβ1-42组小胶质细胞分泌的CXCL1和CCL2水平较空白对照组升高(均P<0.01)，而PF可抑制由Aβ1-42引起的趋化因子分泌的增加(均P<0.01)。结果见图4。

注：TNF-α：肿瘤坏死因子α；IF-1β：白细胞介素-1β；IF-6：白细胞介素-6；Aβ：淀粉样蛋白β，图4～6同；与空白对照组比较，*P<0.01；与Aβ1-42组比较，#P<0.01 图3 ELISA法检测PF对Aβ1-42刺激下小胶质细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-6的影响

注：CXCL1：趋化因子配体1；CCL2：趋化因子配体2；与空白对照组比较，*P<0.01；与Aβ1-42组比较，# P<0.01 图4 ELISA法检测PF对Aβ1-42刺激下小胶质细胞产生CXCL-1和CCL2的影响

2.5 PF抑制小胶质细胞向Aβ1-42的趋化 空白对照组、Aβ1-42组和PF+Aβ1-42组小胶质细胞向Aβ1-42迁移的能力比较差异有统计学意义(F=43.54，P<0.05)。与Aβ1-42组相比，PF预处理的小胶质细胞表现出较弱的向Aβ1-42迁移的能力。具体结果见图5、6。

图5 倒置显微镜下观察各组小胶质细胞向Aβ1-42的趋化迁移(苏木素染色，箭头所示为苏木素阳性细胞)

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与Aβ1-42组比较，#P<0.01 图6 PF对小胶质细胞向Aβ1-42趋化迁移的影响3讨论

3 讨论

AD是导致老年人痴呆的常见病因[7]，目前尚无有效的预防及治疗办法[8]。Aβ来源于β-和γ-分泌酶裂解的淀粉样前体蛋白[9]。大量研究表明，Aβ水平的病理性升高促进了脑内Aβ低聚物的形成，导致突触和/或神经元网络的进行性瓦解[10]。小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞。一方面，活化的小胶质细胞能够部分清除Aβ或Aβ-Aβ受体复合物，进而降低Aβ的毒性；另一方面，聚集在神经炎性斑块的过度活化的小胶质细胞会持续产生神经毒性因子，导致脑损伤进一步加重[11]。因此，调控Aβ诱导的小胶质细胞的活化状态对延缓AD进展有潜在作用。

芍药属植物作为传统中草药在国内已被用于治疗疼痛或炎性反应疾病，对芍药根化学成分的研究发现其具有多种生物活性的化合物，包括单萜苷、三萜类、黄酮类等[12]。PF是一种从芍药根中分离出来的单萜苷，近年来一些学者致力于PF的神经保护作用及作用机制的研究。研究表明，PF能够减轻啮齿动物缺血模型的脑损伤[13]，并减轻谷氨酸或脂多糖引起的神经元损伤[5,14]，抑制脂多糖诱导的小胶质细胞过度产生促炎性介质[14]，证实了PF在缺血动物脑内对小胶质细胞异常活化的抑制作用及神经保护作用。另有早期研究证明PF能够减轻6-羟基多巴胺诱发的神经功能缺损[15]，提示PF在退行性疾病中亦具有神经保护作用[16]。Wang等[6]通过体外实验证实PF可明显减轻Aβ25-35诱导的神经元线粒体功能障碍，其在AD的治疗中具有潜力。值得注意的是，Zhong等[17]研究发现，给AD大鼠腹腔内注射PF能明显减轻记忆障碍和神经元凋亡，表明PF在AD治疗中可能具有一定作用。本研究结果显示，Aβ1-42可诱导啮齿动物小胶质细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的过度产生，而这种作用可被PF所抑制。该实验结果揭示了PF对受Aβ低聚物刺激的小胶质细胞具有神经保护作用。

研究证明，Aβ低聚物不仅诱导小胶质细胞产生过多的促炎性介质，也可促进小胶质细胞分泌趋化因子[18-19]，进而导致其向AD脑内神经炎性斑块过度的聚集和趋化。CXCL1和CCL2等趋化因子水平的升高，使更多的小胶质细胞加速向脑内Aβ募集[20]。因此，降低小胶质细胞的趋化性已被视为控制AD病情进展的一种很有前景的策略。有研究证明PF对3T3-L1[21]和HT-29[22]细胞中的CCL2具有抑制作用。因此本研究探讨了PF对Aβ刺激后小胶质细胞产生CCL2的影响，结果发现PF能够减少由Aβ1-42刺激而导致小胶质细胞产生过多的CCL2。此外，Zhang等[23]研究者发现，与年龄匹配的健康受试者相比，AD患者外周血单核细胞表达更高水平的CXCL1，且CXCL1水平的提高加强了单核细胞向Aβ肽的迁移，提示在AD进展中CXCL1能够促进细胞的趋化性。本研究证实PF预处理可抑制Aβ1-42刺激的小胶质细胞趋化因子的释放，降低了小胶质细胞的趋化性。

综上所述，本研究结果显示，PF预处理降低了Aβ诱导的啮齿动物小胶质细胞过度生成促炎性介质和趋化因子，使小胶质细胞趋化性降低，进而可能发挥神经保护作用。有关PF在AD治疗中的具体作用及其潜在机制，尚需今后进一步研究。

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(本文编辑：时秋宽)

Effect of paeoniflorin on the Aβ1-42-induced inflammation and chemotaxis of microglia

LIUHuayan*，WANGJun.

*DepartmentofNeurology,TheFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,ShenyangLiaoning110001,China

Email：Liuhy@cmu1h.com

Objective To investigate the effect of paeoniflorin (PF) on the beta-amyloid (Aβ)1-42-induced inflammation and chemotaxis of microglia. Methods Primary cultures of rat microglia were pretreated with 0, 5, 25, 50 μmol/L PF respectively. To determine the cytotoxic effect of PF on microglia, CCK-8 assay was performed, and the activity of LDH in culture supernatant was detected. Microglia were divided into three groups: a blank control group (normal culture medium), a positive control group (Aβ1-42-treated cells) and an experimental group (PF-pretreated and then Aβ1-42-treated cells). Levels of tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β, IL-6, chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (CXCL1) and chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2) in the culture supernatant were determined by ELISA kits. Transwell inserts were used to determine the chemotactic migration of microgliainvitro. Results The purity of cultured microglia was more than 90%. PF exerted no significant cytotoxic effect on microglia viability according to CCK-8 assay and LDH assay, no statistical difference between groups (P>0.05) was found. PF suppressed Aβ1-42-induced secretion of proinflammatory mediators (TNF-α, IL-1β and IL-6) and chemokines (CXCL1 and CCL2) from microglia between the experimental group and the positive control group(P<0.01) . And PF inhibited microglial chemotaxis towards Aβ1-42(P<0.05) between the experimental group and the positive control group in the number of migrated cells. Conclusions The above findings suggest that PF reduce Aβ1-42-stimulated production of proinflammatory mediators and chemotactic factors from rodent microglia, as well as inhibit microglial chemotaxis towards Aβ1-42. This suggests that PF might provide a potential new therapeutic strategy for Alzheimer’s disease.

Alzheimer’s disease； beta-amyloid； microglia； inflammation；chemotaxis

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.04.009

国家自然科学基金资助项目(81300939)；辽宁省科学技术计划项目(2009225027)；辽宁省自然科学基金项目(20170541036)

110001中国医科大学附属第一医院神经内科

刘华岩，Email：liuhy@cmu1h.com

R743.9

A

1006-2963(2017)04-0276-06

2016-12-12)