恶臭假单胞菌UW4中趋化受体蛋白的克隆、表达及鉴定

李涛

摘 要：植物根際促生菌因其能够促进植物生长、防治病害的优势日益受到广泛关注，其研究主要集中在假单胞菌类，假单胞菌类在植物根际的定殖主要与趋化作用相关。本研究通过生物信息学软件对恶臭假单胞菌UW4的甲基趋化受体蛋白（MCPs）进行筛选，然后对其进行克隆和表达，结果表明：克隆得到的MCP1可稳定表达，通过对恶臭假单胞菌UW4的甲基趋化受体蛋白的纯化及分析其与不同配体物质的热力学作用强弱，以期找出恶臭假单胞菌特异性的趋化受体，进一步阐明其趋化机理，为恶臭假单胞菌对植物的促生效应提供理论支撑。

关键词：植物根际促生菌；趋化；ACC 脱氨酶；MCP；SDS-PAGE

中图分类号：Q785 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.05.001

Abstrac： The plant growth-promoting rhizosphere bacteria became more and more striking because it could promote the growth， prevent and treat diseases of plant. These researches mainly concentrated on the Pesudomonas. Pesudomonas colonization in plant rhizosphere was related to chemotaxis. This study screened the methyl chemotaxis receptor proteins （MCPs） of Pesudomonas UW4 by using several bioinformatics software， and then cloned and expressed the MCPs. The result showed that the cloned MCP1 could express stably， through the purification of the methyl chemotaxis receptor proteins of Pseudomonas UW4 and analysis the thermodynamic effect of the different ligands with MCPs， we could find out the specificity chemotaxis receptors of Pesudomonas UW4， clarify its chemotaxis mechanism and give some theoretical supporting to the growth-promoting of plant.

Key words： plant growth-promoting rhizosphere bacteria； chemotaxis； ACC deaminase； methyl chemotaxis receptor protein； SDS-PAGE

绿色农业概念的提出源于我国绿色食品产业约二十年长足发展的丰富实践。事实证明，绿色农业是符合我国国情、适合现代农业发展新形势的可持续农业发展形态与模式。农业可持续发展强调逐步减少化肥用量，大力发展农业生物技术产业。植物根际促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）因其能够促进植物生长、防治病害的优势日益受到广泛关注[1]，其研究主要集中在假单胞菌类，该类群能够抑制多种植物病害特别是土传病害的发生[2]，相关研究内容主要涵盖有效根部定殖、抗生作用、根围营养竞争、分泌降解病原微生物的酶等方面。有研究表明，假单胞菌 CHA0 能在铁素缺乏的条件下自然产生水杨酸（Salicylic acid，SA），同时还可提高烟草（Nicotiana tabacum）对烟草花叶病毒的抵抗能力[3]。假单胞菌属（Pseudomonas）还可产生氢氰酸抑制病原真菌根串珠霉（ Thielaviopsis basicola） 引起的烟草黑根病；可分解萎蔫酸进而减轻植物受害程度[2]；还可喷施于蘑菇和经济林植物，可防治霜霉病、托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tolaasii） 等各种病害[4]。

许多PGPR均含有ACC（一氨基环丙烷一羧酸）脱氨酶基因，能够合成 ACC 脱氨酶，利用土壤内的ACC作为氮源，将ACC水解成氨和α-丁酮酸[5]，从而抑制乙烯的合成，以此解除乙烯对植物生长发育的抑制作用。本课题组长期对假单胞菌属中的恶臭假单胞菌UW4进行研究，发现此菌亦含有ACC 脱氨酶，可与植物形成紧密的互惠关系。促使PGPR在植物根部定殖的主要因素有两个：一是PGPR在与土著微生物的竞争中取得优势；二是趋化作用，即白细胞沿浓度梯度向着化学刺激物作定向移动，正是由于植物根系源源不断地分泌各种趋化物质，使得PGPR向根部游动并最终定殖下来。

假单胞菌属的趋化信号通路与类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）相似，除了具有处于细胞端部的甲基趋化受体蛋白（MCP）复合体外，还有一个位于细胞质的受体复合体，鞭毛的运动同时受二者调控。恶臭假单胞菌F1的一个MCP蛋白能够与三羧酸循环中的6个中间产物结合，对苹果酸、延胡索酸、草酰乙酸和琥珀酸有高的亲和力，并能产生强趋化反应，表明MCP对趋化物的亲和力与趋化反应强度有关[6]。

本研究通过生物信息学软件对恶臭假单胞菌UW4的MCP进行筛选，采用拓扑学软件TOPCONS分析其是否具有跨膜结构域；采用NCBI中保守域软件Conserved Domain 分析其是否具有HAMP（Histidine Kinases， Acdenylyl cyclases， Methy binding proteins， Phosphatases）及MCP-signal结构域，采用Phyre2.server软件分析其N-末端是否具有配体结合结构域（LBD），符合以上3个结构特点的推测其可能为一个MCP，并对此MCP1进行了克隆和表达研究。

1 材料和方法

1.1 试验材料

菌株：恶臭假单胞菌UW4（本实验室保藏）。

菌种传代及培养：LB液体及固体培养基。

克隆及表达载体：北京全式金生物pEASY-Blunt E1 Expression Kit； SanPrep 柱式质粒DNA 小量抽提试剂盒，上海生工生物工程有限公司；Pfu DNA polymerase：北京GenStar公司；

引物合成及测序：华大基因；克隆及表达菌株：北京庄盟国际生物基因科技有限公司DH5a及BL21（DE3）。

1.2 试验方法

1.2.1 生物信息学分析 通过对NCBI中基因组的序列比对，在UW4中找到一个登录号为WP_015093116.1 ，注释为甲基受体趋化蛋白methyl-accepting chemotaxis sensory transducer [Pseudomonas sp. UW4]的蛋白质，使用TOPCONS软件分析其是否具有跨膜结构域， NCBI中Conserved Domain 分析其是否具有HAMP及MCP-signal domain；使用Phyre2 server分析其N-末端是否具有配体结合结构域（LBD），最终确定其具备以上3个结构特征，推测可能为UW4的一个MCP1。

1.2.2 MCP的克隆及原核表达 根据pEASY-Blunt E1 Expression Kit载体特征，设计引物进行MCP1平末端片段的克隆，片段長度为1 917bp，引物序列如表1所示。

将克隆得到的MCP1片段进行琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，连至pEASY-Blunt E1 Expression Kit，采用化学转化法将此质粒转入DH5a，挑取转化子进行阳性克隆鉴定，将鉴定成功的pEASY-Blunt E1-MCP1重组质粒送测序，测序结果与目的片段同源率为100%。将此重组质粒转入表达菌株BL21（DE3），挑取转化子进行菌液PCR及质粒提取鉴定，将鉴定成功的带有pEASY-Blunt E1-MCP重组质粒的BL21（DE3）以1%接种量接至含Amp的LB液体培养基中，37 ℃，220 rpm摇菌，培养至OD600=0.4～0.6，加入不同浓度（0.1～1.0 mmoL·L-1）的诱导剂IPTG，25 ℃过夜诱导使蛋白表达。

1.2.3 SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白 （1）样品制备。取2 mL菌液，12 000 rpm离心2 min后重悬至2 mL PBS 缓冲液中，进行细胞破碎15 min，分出上清和沉淀后，将沉淀重悬至100 μL。将上清和沉淀样品中分别加入5×上样缓冲液，混合均匀后将其置于100 ℃沸水浴中煮沸10 min，后取出冷却放置于-20 ℃备用。

（2）电泳过程。制备好分离胶及浓缩较后组装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样约10 μL，接好电极开始电泳，开始电场强度为80 V，待染料进入分离胶后，将电场强度调至120 V，继续电泳直至染料抵达分离胶底部，断开电源。

（3）凝胶的固定及染色。取出胶片，用至少5倍体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，放在摇床上室温缓慢旋转约20 min染色，染色完成后将凝胶置于脱色液浸泡，缓慢摇动4～8 h脱色，其间更换脱色液2～3次，至凝胶背景透明。将脱色后的凝胶照相或干燥保存。

2 结果与分析

2.1 MCP1克隆及测序

利用表1中的引物进行MCP1片段克隆，结果如图1所示。

将鉴定成功的pEASY-Blunt E1 Expression Kit-MCP1重组质粒转化子送测序（图2），测序结果与目的片段同源率达100%。

2.2 构建表达菌株

将测序成功的重组质粒转化入表达菌株BL21（DE3），后提取质粒鉴定转化是否成功，结果如图3所示。

将鉴定成功的表达菌株BL21（DE3）-MCP1以1%接种量接至含Amp的LB液体培养基中，37 ℃，220 rpm摇菌，培养至OD600=0.4～0.6，加入不同浓度（0.1～1.0 mmol·L-1）的诱导剂IPTG，25 ℃过夜诱导使蛋白表达。

2.3 SDS-PAGE电泳结果

将诱导完成的菌液取2 mL进行样品前处理后，进行SDS-PAGE电泳观察表达情况，电泳结果如图4和图5所示。

从上图4和图5中可以看出：MCP1在加入诱导剂IPTG 0.5～0.9 mmol·L-1时诱导效果良好，MCP1表达量较多，但主要以包涵体形式存在，上清中基本未见表达。

3 结论与讨论

以上结果表明：克隆得到的MCP1可稳定表达，但多数在沉淀中，上清中表达量偏少。下一步尝试采用低温低速诱导方式，使MCP1能够可溶性表达并采用固定金属亲和层析法分离纯化得到有活性的纯蛋白，然后通过等温滴定（Isothermal titration calorimetry）和热漂移试验（Fluorescence-based thermal shift assay）分析MCPs与各类不同趋化物质（配体）之间亲和力的大小即热力学作用强弱，以期找出恶臭假单胞菌特异性的趋化受体，进一步阐明其趋化机理，为恶臭假单胞菌对植物的促生效应提供理论支撑。

参考文献：

[1]TARIQ M， ALI Q， KHAN A， et al. Yield potential study of Capsicum annuum L.under the application of PGPR[J].Advancements in life sciences， 2014， 1（4）： 202-207.

[2]IPEK M ， PIRLAK L ， ESITKEN A， et al. Plant growth-promoting rhizobacteria （Pgpr） increase yield， growth and nutrition of strawberry under high-calcare-ous soil conditions [J]. Journal of plant nutrition， 2014， 37（7）： 990-1001.

[3]MAURHOFER M， REIMMANN C， SCHMIDLI P S， et al. Salicylic acid biosynthetic genes expressed in Pseu-domonas fluorescens strain P3 improve the induction of systemic resistance in tobacco against tobacco necrosis virus[J]. Phytopathology， 1998， 88（7）： 678-684.

[4]杜爱玲， 王进涛. 覆土微生物对双孢蘑菇菌丝体生长的影响[J]. 华中农业大学学报， 1999， 18（3）： 242-244.

[5]蒙渊， 王卫卫， 陈兴都， 等. 氢氧化细菌分离、筛选及促生机制研究进展[J]. 微生物学通报， 2010， 37（10）： 1525-1532.

[6]LACAL J， ALFONSO C， LIU X， et al. Identification of a chemoreceptor for tricarboxylic acid cycle intermediates differential chemotactic response towards receptor ligands[J]. Journal of biological chemistry， 2010， 285（30）： 23126-23136.