高效液相色谱-串联质谱法测定蜂胶原胶中氯霉素的残留量

邵琳智，谢敏玲，林 峰

(1.广东出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，广东 广州 510623；2.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东 广州 510623)

高效液相色谱-串联质谱法测定蜂胶原胶中氯霉素的残留量

邵琳智1,2*，谢敏玲1,2，林 峰1，2

(1.广东出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，广东 广州 510623；2.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东 广州 510623)

建立了高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定蜂胶原胶中氯霉素残留量的分析方法。样品用叔丁基甲醚溶解，氢氧化钠溶液去除黄酮类等杂质，叔丁基甲醚层加正己烷降低氯霉素的溶解度，再用乙酸钠缓冲液反萃氯霉素，反萃溶液调至碱性后用乙酸乙酯萃取，经浓缩、复溶和过滤后，进行测定。采用甲醇-水(65∶35，体积比)为流动相，反相Atlantis T3色谱柱进行液相色谱分离，电喷雾负离子电离(ESI-)，多反应监测模式(MRM)进行检测，内标法定量。结果表明，氯霉素在0.1～5.0 μg/L 范围内线性关系良好；方法的定量下限(S/N≥10)为0.3 μg/kg；在0.3、0.6、3.0 μg/kg 加标水平下，氯霉素的平均回收率为97.3%～103%，相对标准偏差为4.8%～6.4%。该法的灵敏度、准确度和精密度均符合兽药残留检测的要求。

蜂胶原胶；氯霉素；高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)

蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂，将其混入上颚腺、蜡腺的分泌物加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。蜂胶植物来源广泛，化学成分复杂，已鉴定出20余类、300多种天然成分，其中包括100多种黄酮类化合物、100多种芳香类化合物，还有丰富的有机酸、萜烯类物质、维生素、木脂体、酶类、矿物元素、氨基酸、多糖等具有生物活性的天然成分[1]。蜂胶具有广泛的医疗保健作用，近年来受到越来越多消费者的亲睐，其安全性问题也成为广大消费者关注的热点。

氯霉素对人体有严重的副作用，易引起人粒细胞缺乏病、再生障碍性贫血和溶血性贫血[2]，许多国家和地区已将其列入食品中禁止使用的药物名单[3]。但氯霉素作为一种广谱抗生素，是预防和治疗蜜蜂细菌性疾病(美洲幼虫腐臭病、欧洲幼虫腐臭病等)的有效药物之一[4]，且在蜜蜂养殖业中存在滥用情况，导致了该药物在蜂产品中的残留。

就检测仪器而言，目前采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定氯霉素已成国家标准方法，该方法灵敏度高、抗干扰能力强。但由于蜂胶化学成分特别复杂，要检测其中的氯霉素残留量，不仅对仪器灵敏度、重现性与选择性的要求非常高，更关键的问题在于需要良好的样品前处理手段来提取和净化目标化合物。目前，动物肌肉与内脏、水产品、乳制品、蜂蜜和蜂王浆等动物源食品中氯霉素残留量的检测方法已比较完善，国家标准、行业标准和相关文献均可参考[5-12]，但均不适用于蜂胶原胶样品。对蜂胶原胶样品而言，可供参考的文献非常少[13-14]，其化学成分特别复杂，检测其中的痕量兽药残留极其困难，至今未有任何检测蜂胶原胶中兽药残留的标准方法。本研究建立了一种蜂胶原胶中氯霉素残留量的测定方法，充分应用待测物和干扰物在不同溶剂间的溶解度差异，解决了蜂胶原胶样品的溶解、氯霉素的提取和干扰物的净化等问题，已成功应用于实际样品的检测。本方法采用的提取和净化溶剂尚未见文献报道，方法新颖，具有首创性，且操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，定性定量准确，从而为制订蜂胶原胶中的兽药残留检测标准提供了有力的技术支持，也为相关部门监管蜂胶安全提供了技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UFLC-XR高效液相色谱仪(日本岛津公司)；API3000三重四极杆串联质谱仪(美国AB Sciex公司)；MS3型涡旋振荡器(德国IKA公司)；Sigma3-30K台式冷冻离心机(德国Sigma公司)；Turbo Vap LV水浴氮吹仪(美国Biotage公司)；Milli-Q Advangtage A10超纯水系统(美国Millipore 公司)。

氯霉素标准品(纯度为98.5%，Dr.Ehrenstorfer公司)，氯霉素-D5标准溶液(100 μg/mL，Dr.Ehrenstorfer公司)；甲醇、叔丁基甲醚(色谱纯，Fisher公司)；乙酸乙酯、正己烷、氢氧化钠、乙酸钠(分析纯，广州化学试剂厂)；实验用水为超纯水(符合GB/T 6682-2008 一级水要求)；分析样品为实验室送检样品。

1.2 标准溶液的配制

精密称取氯霉素10 mg置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成质量浓度为100 mg/L的氯霉素标准储备液，-18 ℃避光保存。将氯霉素标准储备液和氯霉素-D5标准溶液逐级稀释，配制成氯霉素质量浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/L，氯霉素-D5质量浓度为0.3 μg/L的系列标准溶液。

1.3 样品前处理

蜂胶原胶样品在15 ℃以下时，变脆变硬，易粉碎，若室温在15 ℃以上，可置于-18 ℃冰箱冷冻2 h以上，取出后立刻敲碎，敲碎后的样品作为供试样品。

称取1.0 g(精确至0.01 g)样品于50 mL具塞离心管中，加20 μg/L氯霉素-D5内标溶液30 μL，加叔丁基甲醚8 mL，涡旋3 min，使蜂胶充分溶解，加4%氢氧化钠溶液10 mL，涡旋2 min，8 000 r/min离心5 min，上层叔丁基甲醚移入另一洁净50 mL离心管中，先加0.2 mol/L乙酸钠溶液10 mL，再加正己烷7 mL，涡旋2 min，4 000 r/min离心5 min，下层乙酸钠溶液移入另一洁净50 mL离心管中，上层再加0.2 mol/L乙酸钠溶液5 mL反萃1次，4 000 r/min离心5 min，合并两次乙酸钠溶液反萃液，用氨水调pH值至10±0.2，加乙酸乙酯10 mL，涡旋3 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液45 ℃氮吹浓缩至干，加纯水1 mL复溶，涡旋2 min，过0.22 μm滤膜后，采用HPLC-MS/MS测定。

1.4 HPLC-MS/MS条件

液相色谱条件：色谱柱为Atlantis T3柱(4.6 mm×100 mm，3 μm，Waters公司)；流动相为甲醇-水(65∶35)；流速为0.3 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为20 μL。

质谱条件：电喷雾负离子源模式(ESI-)；多重反应监测(MRM)；雾化气(NEB)设为10；气帘气(NEB)设为10；碰撞气(CAD)设为10；喷雾电压(IS)为-4 000 V；离子化温度(TEM)为500 ℃；MRM监测离子对、碰撞能量等参数见表1。

表1 氯霉素和氯霉素-D5的质谱参数

*quantitative ion

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

氯霉素属于中等极性化合物，在C18柱上有一定的保留，现有国家标准和参考文献多采用C18柱[5-10]进行检测。本实验尝试选择Atlantis T3柱(4.6 mm×100 mm，3 μm)测定氯霉素，该柱采用三官能团C18烷基键合相，保证了键合密度能提升极性化合物的保留并且100%水相兼容，专有的端基封尾技术将更多的游离硅羟基反应完全，其键合和端基封尾技术的结合，不仅提供了完美的峰形，且柱寿命较长。相同规格的T3柱与C18柱，若保留时间相同，T3柱的有机相比例应有所提高。对氯霉素而言，选择T3柱可将流动相中甲醇的比例提高至65%甚至更高。而甲醇的比例越高，质谱离子化越好，响应越高。本实验最终选择Atlantis T3柱(4.6 mm×100 mm，3 μm)。其他仪器条件，如质谱条件可参考氯霉素测定的液相色谱-串联质谱法的国家标准。

2.2 前处理条件的优化

蜂胶原胶的成分特别复杂，其他动物源食品，如动物肌肉与内脏、水产品、乳制品、蜂蜜和蜂王浆的前处理方法完全不适于蜂胶原胶。而以蜂胶为原料的保健品由于制剂辅料的加入，在有机溶剂中的溶解度发生变化，所以方法也不适用[15]。提取蜂胶中的氯霉素，首先需将蜂胶原胶完全溶解。蜂胶原胶可溶于2%NaOH、乙醇和醚类。有文献采用NaOH和乙醇溶解蜂胶[13-14]，高氯酸溶液和水提取其中的氯霉素，但加入提取液后均会立即产生大量胶状沉淀，从而导致氯霉素包裹在沉淀中，难以提取出来。本实验采用叔丁基甲醚溶解蜂胶原胶，蜂胶中大量的黄酮类化合物等杂质可用氢氧化钠溶液去除，而氯霉素仍保留在叔丁基甲醚层中。去除蜂胶中的黄酮类干扰物是净化的关键步骤，有文献采用乙酸铅沉淀法[14]，但由于乙酸铅主要与具有邻二酚羟基结构的化合物形成沉淀，不能去除其他不含此结构的化合物。本实验比较了0.2%、1%和4%氢氧化钠溶液的除杂质效果，结果显示，4%的氢氧化钠溶液能去除绝大部分黄酮类化合物，而且还能溶解部分树胶等物质，净化效果较好，因此最终选择4%的氢氧化钠溶液去除杂质。

由于叔丁基甲醚与水溶液不互溶，可采用缓冲液将氯霉素反萃取出来，氯霉素在叔丁基甲醚中有一定的溶解度，直接加缓冲液难以将其反萃出来，故在叔丁基甲醚层中加入一定量的正己烷以降低氯霉素的溶解度，再用乙酸钠缓冲液反萃取氯霉素。本实验优化了正己烷的加入量，使正己烷与叔丁基甲醚的体积比分别为0.5∶1、1∶1、2∶1，结果表明正己烷比例过低时，氯霉素不易被反萃取出来，过多则会出现胶状沉淀，导致氯霉素易包裹其中，降低其回收率。当正己烷与叔丁基甲醚体积比为1∶1时能获得满意结果。反萃取溶液调至碱性后用乙酸乙酯萃取，若反萃取溶液pH值低于7.0，乙酸乙酯对氯霉素的萃取效率较差，pH值越低，萃取效率越差，调至碱性后，一次即可将氯霉素完全萃取出来。溶液pH值对氯霉素绝对回收率的影响结果表明，pH 10.0时的萃取效率最为理想。

通过上述几次液液萃取，完成了氯霉素的提取和净化，整个过程中氯霉素始终保留在溶解度相对较大的溶剂中，条件温和，净化效果显著。经上述优化方法前处理后，氯霉素的空白和加标样品色谱图见图1。

2.3 线性范围、方法检出限与定量下限

为了消除基质效应以及电喷雾离子化的不稳定性对测定结果的影响，本方法采用同位素稀释技术，取不同浓度的氯霉素系列标准溶液，以氯霉素响应峰面积与内标氯霉素-D5响应峰面积之比(y)对氯霉素的质量浓度(x，μg/L)进行线性回归。结果表明，氯霉素的质量浓度在0.1～5.0 μg/L范围时，方法的线性关系良好，线性方程为y= 3.34x+0.015，相关系数(r)为0.999 8。在空白蜂胶中添加不同质量浓度的氯霉素标准溶液，按本方法处理样品，当信噪比S/N≥3时，确定方法的检出限(LOD)为0.1 μg/kg，当S/N≥10且回收率和相对标准偏差均符合残留检测方法要求，确定方法的定量下限(LOQ)为0.3 μg/kg。

2.4 方法的回收率与精密度

采用在空白蜂胶中添加标准溶液的方法进行回收率试验，内标法校正，分别按照低(LOQ)、中(2 LOQ)、高(10 LOQ)3个浓度水平进行加标回收率测定，每个水平平行测定6个样品，结果表明，氯霉素的平均回收率为97.3%～103%，相对标准偏差(RSD)为4.8%～6.4%。本方法的准确度和精密度均符合有关标准和法规的要求。

2.5 实际样品分析

应用本方法对实验室送检的50个蜂胶原胶样品进行检测，其中有6个样品检出氯霉素，含量分别为1.3、2.1、2.5、3.6、14、46 μg/kg，其余样品结果均低于定量下限(0.3 μg/kg)。

3 结 论

本文采用新颖的提取和净化溶剂，利用目标化合物和干扰物在不同溶剂间的溶解度差异，解决了蜂胶原胶样品的溶解、氯霉素的提取和分离等难题，建立了一种蜂胶原胶中氯霉素残留的HPLC-MS/MS检测方法。本方法简便快捷，灵敏度高，抗干扰能力强，符合残留检测的相关要求，可为蜂胶原胶的监管提供有效的方法支撑。

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Determination of Chloramphenicol in Propolis by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SHAO Lin-zhi1,2*，XIE Min-ling1,2，LIN Feng1，2

(1.Inspection and Quarantine Technical Centre of Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou 510623，China；2.Key Laboratory of Animals and Plants and Food Import and Export of Technical Measures in Guangdong Province，Guangzhou 510623，China)

A method was developed for the determination of chloramphenicol in propolis by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The flavonoid was removed with NaOH after the dissolution of the sample with methyl tert-butyl ether(MTBE).The solubility of chloramphenicol in MTBE was decreased withn-hexane，and then chloramphenicol was extracted with sodium acetate buffer.After the extraction was transferred to alkaline solution，ethyl acetate was used to extract chloramphenicol.The supernatant was evaporated,and re-dissolved with water for detection.The separation of chloramphenicol was performed on an Atlantis T3column with methanol and water(65∶35，by volume) as mobile phases，and the detection of chloramphenicol was carried out by tandem mass spectrometry in negative electrospray ionization(ESI-) and multiple reaction monitoring(MRM) mode.The quantification was performed by the internal standard method.The calibration curve showed a good linearity in the range of 0.1-5.0 μg/L.The limits of quantitation(S/N≥10) were 0.3 μg/kg.The recoveries at three spiked levels were in the range of 97.3%-103%with relative standard deviations of 4.8%-6.4%.With the advantages of sensitivity，strong anti-interference capability，good recovery and repeatability，the method was suitable for the monitoring of veterinary residue analysis

propolis;chloramphenicol；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

2017-04-05；

2017-05-10

广东省省级科技计划项目(2015A030401075)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.014

O757.72； TQ460.72

A

1004-4957(2017)08-1029-05

*通讯作者：邵琳智，硕士，高级工程师，研究方向：食品分析，Tel：020-38290337，E-mail：slz9741430@sina.com