miRNA-506在乳腺癌中的表达及其意义

汪进城,汪 虎,张 配,刘永红,许培权*

(1蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科,蚌埠 233004;2蚌埠医学院药学院;*通讯作者,E-mail:xupeiquan2003@sina.com)

miRNA-506在乳腺癌中的表达及其意义

汪进城1,汪 虎1,张 配2,刘永红1,许培权1*

(1蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科,蚌埠 233004;2蚌埠医学院药学院;*通讯作者,E-mail:xupeiquan2003@sina.com)

目的 探讨microRNA-506(miR-506)在乳腺癌患者中的表达水平,并进一步研究其临床意义。 方法 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测miR-506在30例乳腺癌组织及其癌旁正常组织、10例乳腺良性病变组织中的表达水平,用P50(P25,P75)表示;使用免疫组化的方法检测乳腺癌组织中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、HER-2、Ki-67和P53的表达;分析miR-506与乳腺癌临床病理特征之间的关系。 结果 乳腺癌组织中miR-506表达水平为0.301 0(0.069 5,0.349 3),明显低于正常组织2.361 5(1.906,3.658 0)和良性组织2.671 5(2.274,2.992 5),差异有统计学意义(P<0.05);miR-506在正常组织和良性组织中的表达水平差异无统计学意义(P>0.05);乳腺癌组织中miR-506水平在不同肿瘤大小、有无淋巴结转移、不同HER-2和Ki-67表达之间差异有统计学意义(P<0.05),但在不同年龄、不同组织学分级、不同TNM分期、不同ER、PR和P53表达之间差异均无统计学意义(P>0.05)。 结论 miR-506在乳腺癌组织中的表达水平降低,miR-506可能参与乳腺癌的病理过程,发挥类似抑癌基因的作用。

乳腺癌; miR-506; qRT-PCR; 免疫组织化学

乳腺癌(breast cancer)是一种好发于女性的恶性肿瘤,常表现为乳腺肿块、皮肤改变以及腋窝淋巴结肿等,现今已成为全球女性最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着女性的身心健康[1-3]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类广泛存在于真核细胞中长约18-23个核苷酸的小分子非编码RNA,具有转录后基因调控的功能,参与调节细胞的分化、增殖、凋亡、迁移等多种生物学进程[4]。现在已发现和证明了许多人类恶性肿瘤中都存在异常表达的miRNA, miRNA因表达的不同、作用靶基因的不同,发挥着抑癌或者致癌基因的角色[5-7]。miR-506位于X染色体上,为miR-506-514群的一员,在多种恶性肿瘤中表达降低[8-11]。本研究旨在探索miRNA-506在乳腺良性病变、乳腺癌及其癌旁组织中的表达差异,并分析其在乳腺癌组织中的表达以及与乳腺癌临床病理特征之间的关系,进而为乳腺癌的诊断、治疗及预后提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织来源 组织标本来自蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科2016-11～2017-01乳腺癌手术标本及其对应的癌旁正常组织各30例(癌旁正常乳腺组织取自距离癌组织边缘≥5 cm且与肿块不在同一象限),另取乳腺纤维腺瘤组织10例。所有患者手术前均未接受放疗、化疗等治疗,所有标本均经术后病理确诊。所取组织一部分迅速置于液氮中,后转入-80 ℃低温保存,另一部分行常规免疫组化。乳腺癌的TNM分期依据美国癌症联合委员会(AJCC)2003版乳腺癌TNM分期;乳腺癌常规免疫组化结果判读依据2012年美国临床肿瘤学会(ASCO)的阳性判断标准。

1.1.2 主要试剂 逆转录剂盒购自中国Takara公司;GeneJET RNA Purification Kit(K0731)RNA提取试剂盒、Real-time PCR试剂盒均购自美国Thermo Fisher Scientific公司;SP免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司;HER-2基因扩增检测试剂盒购自北京安必奇生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取 按照GeneJET RNA Purification Kit(K0731)RNA提取试剂盒方法提取所需RNA,紫外分光光度仪测定RNA溶液OD260 nm/OD280 nm的吸光度值,计算RNA的浓度和纯度;行RNA琼脂糖凝胶电泳试验测定其完整性。将检验合格的RNA置于-80 ℃冰箱保存,用于逆转录成cDNA。

1.2.2 逆转录成cDNA 将已提取的RNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (RR047A)逆转录试剂盒说明书依次逆转录成cDNA,逆转录采用20 μl反应体系：RNA sample 10.0 μl,PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μl,RT Primer 1.0 μl,5×PrimeScript Buffer 24.0 μl,RNase Free dH2O 4.0 μl。反应条件为37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,反应产物保存于4 ℃。

1.2.3 实时荧光定量PCR 以U6作为内参基因，使用Power SYBR®Green PCR Master Mix试剂盒和进行实时荧光定量PCR反应。采用20 μl反应体系：2×SYBR Green 10 μl，Primer mix 1.6 μl，RT product 1 μl，DNase-free Water 7.4 μl。反应条件为：95 ℃ 10 min变性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。所有反应均设立3个复孔，记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即Ct值。实验采用定量PCR中的相对定量法进行分析，ΔCt癌=Ct待测基因-CtU6,ΔCt正常=Ct待测基因-CtU6，ΔΔCt=ΔCt癌-ΔCt正常，F=癌/正常=2-ΔΔCt(F即代表癌组织相对正常组织的表达变化倍数)。

1.2.4 免疫组化 按照SP试剂盒说明书对乳腺癌标本组织进行免疫组化染色,以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照,用试剂公司提供的阳性切片作对照。所得试验结果由本院病理科两名专业医师在双盲的前提下阅片分析并判断结果。

1.3 统计学分析

本实验采用SPSS16.0统计软件进行统计分析,miRNA-506的表达数据以P50(P25,P75)来表示。多组独立样本间比较采用Kruskal-Wallis H检验,多样本间两两比较采用秩转换后的LSD检验,miRNA-506表达水平与临床病理特征的关系应用Fisher确切概率法检验。所有实验结果统计值均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR特异性检测

miRNA-506的扩增曲线平滑,基线期、对数期、平台期明显,扩增效果满意(见图1)。溶解曲线呈现单一峰,溶解温度在80-90 ℃之间,表明无引物二聚体或其他非特异性扩增片段产生,实验结果特异性很高(见图2)。

2.2 miRNA-506在乳腺癌、癌旁正常组织以及乳腺纤维腺瘤中的表达

首先采用Kruskal-WallisH检验比较miRNA-506在正常乳腺组织、乳腺良性病变组织和乳腺癌组织中的表达水平差异(见表1),然后再对数据进行秩转换后采用LSD检验进行三者间两两比较。结果显示乳腺癌组织中的miRNA-506表达水平低于癌旁正常组织以及乳腺良性病变组织,差异有统计学意义(P<0.05);癌旁正常组织与乳腺良性病变组织中的miRNA-506表达水平未见明显差异(P>0.05)。

图1 miRNA-506扩增曲线

Figure 1 Amplification curve of miRNA-506

图2 miRNA-506溶解曲线

Figure 2 Dissolution curve of miRNA-506

表1 miRNA-506在正常乳腺组织、乳腺良性病变组织和乳腺癌组织中表达水平

Table 1 The expression level of miRNA-506 in normal breast tissues, benign breast lesions and breast cancer tissues

组织miRNA-506相对表达量χ2P乳腺癌组织0.3010(0.0695,0.3493)6.1310.047正常组乳腺组织2.3615(1.9060,3.6580)*#乳腺良性病变组织2.6715(2.2740,2.9925)*

与乳腺癌组织比较,*P<0.05;与乳腺良性病变组织比较,#P>0.05

2.3 常规免疫组化检查结果

本实验所有乳腺癌标本均行术后免疫组化检查,包括ER、PR、HER-2基因、Ki-67基因、P53基因,HER-2结果为阴性或者(+)均判定为阴性,HER-2免疫组化为(++)的,均进一步行FISH检测。本实验中,有2例标本经免疫组化检测示HER-2(++),遂行FISH检测,依据乳腺癌HER2检测指南2014版,对此2例HER-2(++)标本判定为阳性(见图3)。

图3 FISH检测HER-2扩增阳性Figure 3 HER-2 amplification positive in FISH detection

2.4 miRNA-506的表达与乳腺癌临床病理特征的关系

以miR-506相对表达的平均值0.301为分界,将30例标本分为miRNA-506高表达组(n=12)和miRNA-506低表达组(n=18),采用Fisher精确检验，结果表明miR-506在乳腺癌组织中的表达水平在不同肿瘤大小、有无淋巴结转移、不同HER-2和Ki-67表达之间差异有统计学意义(P<0.05),但在不同年龄、不同组织学分级、不同TNM分期、不同ER、PR和P53表达之间差异均无统计学意义(P>0.05，见表2)。

3 讨论

乳腺癌现阶段已成为女性最常见的恶性肿瘤之一,据美国癌症协会发布的2015年癌症统计数据报道显示,乳腺癌仍占女性癌症发病率的首位[2]。而在我国,乳腺癌的发病率情况也不容乐观。根据国家癌症中心发布的2017年中国最新癌症数据显示,乳腺癌在我国城市地区女性中的发病率已经跃居第一位。目前,我国对于乳腺癌的就诊存在着病期偏晚,远处转移较为常见的现状,这就使得乳腺癌的总体预后较差[3]。现阶段对乳腺癌的诊断主要还是依据临床症状以及影像学的检查,缺乏比较特异性的临床检测指标。因此,寻找一种能够强有力地评估乳腺癌的发生、发展,诊断、治疗及预后的生物学指标就变得十分迫切。

表2 miRNA-506的表达与乳腺癌患者临床病理之间的关系 (例)

Table 2 Relationships between the expression of miRNA-506 and clinicopathological features in patients with breast cancer (cases)

病理参数miRNA-506高表达miRNA-506低表达P年龄0.660 ≤50岁33 >50岁915组织学分级0.457 Ⅰ+Ⅱ级77 Ⅲ级511肿瘤大小0.009 ≤2cm83 >2cm415淋巴结转移0.000 有114 无114TNM分期0.266 Ⅰ期65 Ⅱ+Ⅲ期613ER1.000 阳性811 阴性47PR0.442 阳性910 阴性38HER-20.001 阳性316 阴性92Ki-670.004 阳性416 阴性82P530.722 阳性79 阴性59

越来越多的研究表明,miRNA在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用[5-7]。miR-506位于X染色体上,为miR-506-514群(miR-506,miR-507,miR-508,miR-509,miR-510,miR-513,miR-514)的一员,在肝癌[9]、胰腺癌[10]和胃癌[11]等肿瘤中表达降低。但同时也有研究发现miR-506在肺癌[12]和黑色素瘤[13]中表达升高,这表明miR-506在不同的肿瘤中可能发挥着不同的作用。

在本实验中,我们通过使用qRT-PCR方法检测乳腺癌组织中miR-506的表达水平,通过与乳腺正常组织以及乳腺良性组织相比较,乳腺癌组织中miR-506的表达水平明显低于二者(P<0.05),表明miR-506的下调可能与乳腺癌的发生相关,并且在乳腺癌的发生中可能发挥着抑癌基因的作用。在分析乳腺癌组织中miR-506的表达水平与临床病理特征之间的关系发现,miR-506在乳腺癌组织中的表达水平在淋巴结是否转移、不同肿瘤大小、不同HER-2和Ki-67表达之间差异有统计学意义(P<0.05),而在患者不同年龄、不同组织学分级、不同TNM分期、不同ER、PR、以及P53表达之间差异无统计学意义(P>0.05)。

HER-2是编码第2人表皮生长因子的癌基因,参与了调控细胞增长、促进肿瘤增殖及分化,已经成为评估乳腺癌患者预后的独立因素[14],本实验中miR-506在HER-2阳性、淋巴结转移乳腺癌患者中的表达水平明显低于HER-2阴性、淋巴结无转移患者,表明miR-506可能在乳腺癌中发挥着抑癌基因的作用,并参与了乳腺癌的发生、发展。Ki-67作为一种和细胞增殖相关的核抗原,与乳腺癌的生长、转移以及侵袭有着密切关系,是评估乳腺癌诊断和预后的一个重要指标[15],本实验中miR-506的表达水平的高低和Ki-67有关联,这也提示miR-506高表达可能对于乳腺癌的预后起到积极的作用。miR-506与乳腺癌癌灶大小的关系尚未在相关的研究中发现,本实验结果也为乳腺癌和肿瘤大小在影响预后方面的研究提供一个方向。同时,本实验也存在着病例数量较少以及缺乏随访等不足,无法进一步评估miR-506在乳腺癌患者预后中的精确价值。

综上所述,miR-506在乳腺癌组织中的表达水平降低,miR-506可能参与乳腺癌的病理过程,发挥类似抑癌基因的作用。虽然其在乳腺癌中的作用机制还有待进一步研究,但相信随着研究的不断深入,miR-506有可能作为乳腺癌的诊断标志物及治疗、预后的靶标。

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Expression and clinical significance of microRNA-506 in breast cancer

WANG Jincheng1,WANG Hu1,ZHANG Pei2,LIU Yonghong1,XU Peiquan1 *

(1DepartmentofSurgeryOncology,FirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China;2SchoolofPharmacy,BengbuMedicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail:xupeiquan2003@sina.com)

ObjectiveTo explore the expression of microRNA-506(miR-506) in breast cancer and its clinical significance.MethodsThe real-time quantitative PCR(qRT-PCR) method was used to detect miR-506 expression level in 30 cases of breast cancer tissues and adjacent normal tissues and 10 cases of benign breast tissues, and the data were represented byP50(P25,P75).The immunohistochemistry method was used to detect the expression of estrogen receptor(ER), progesterone receptor(PR), HER-2, Ki-67 and P53 in breast cancer tissues. The relationships between miR-506 and clinicopathological features of breast cancer were analyzed.ResultsThe expression level of miR-506 in breast cancer tissues was significantly lower than that in normal tissues and benign tissues(P<0.05). The expression levels of miR-506 in normal tissues and benign tissues were not significantly different(P>0.05). The level of miR-506 was correlated with tumor stage, lymph node metastasis,expression of HER-2 and Ki-67(P<0.05), but not with age, histological grade, TNM stage,expression of ER, PR and P53(P>0.05).ConclusionThe expression level of miR-506 in breast cancer tissues is decreased, and it may be involved in the pathological process of breast cancer, and play a role of tumor suppressor genes.

breast cancer; microRNA-506; qRT-PCR; immunohistochemistry

国家自然科学基金资助项目(81603155);安徽省自然科学基金青年基金资助项目(1708085QH212)

汪进城，男，1991-12生，在读硕士，E-mail:18725527900@163.com

2017-05-13

R737.9

A

1007-6611(2017)08-0847-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.020