艾炷灸抗哮喘小鼠气道炎症机制研究

谢玲玲，李品纯，潘凤霞，朱北胜，李 梅

(崇左市人民医院中医康复科， 广西 崇左 532200)

【针灸研究】

艾炷灸抗哮喘小鼠气道炎症机制研究

谢玲玲，李品纯，潘凤霞，朱北胜，李 梅

(崇左市人民医院中医康复科， 广西 崇左 532200)

目的：通过观察艾炷灸对哮喘模型小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)水平的影响，探讨其抗哮喘气道炎症的作用机制。方法：昆明种小鼠32只按随机数字表法分为空白组、哮喘模型组、艾炷灸治疗组、硫酸特布他林(Terbutaline Sulfate,TS)阳性组，空白组用生理盐水腹腔注射和雾化吸入，其余各组采用卵清蛋白(OVA)腹腔注射致敏和雾化激发哮喘，哮喘模型制作成功后，分别利用生理盐水雾化、TS雾化液、艾炷灸进行治疗，2周后测小鼠血清的MDA、SOD、NO值，观察对比各组肺组织形态。结果： 与空白组比较，哮喘模型组小鼠血清MDA、NO水平显著增高；与哮喘模型组比较，TS阳性组、艾炷灸治疗组的MDA水平显著降低；与空白组比较，哮喘模型组小鼠血清SOD水平显著降低；与哮喘模型组比较，TS阳性组、艾炷灸治疗组的SOD水平显著增加。结论: 艾炷灸能明显抑制哮喘小鼠气道炎症，其机制可能与其降低机体NO、MDA水平，增强SOD的活力有关。

哮喘；艾炷灸；气道炎症；抗氧化

中医认为，哮喘是由于寒邪伤肺、肺肾两虚等导致痰气交阻、阻塞气道、肺气升降不利进而出现呼吸困难、气息喘促[1]。艾灸是利用灸火温热性给予人体温热刺激，渗透入经络腧穴，是治疗和防治疾病的一种方法，其温经散寒、活血通络、扶阳固脱是中医学治疗哮喘的常用治疗方法。临床观察发现，艾灸不仅对改善肺通气功能有显著效果，而且能调节机体免疫功能，对于变态反应性疾病和气道反应性疾病有很重要的作用，并能有效控制哮喘发作[2]。

本实验利用小鼠复制哮喘模型，使用艾炷灸对哮喘小鼠进行治疗，观察肺组织病理形态学改变，并对比小鼠血清MDA、SOD、NO水平，从而分析艾炷灸抗哮喘模型小鼠气道炎症机制。

1 资料与方法

1.1 动物与分组

选取广西中医药大学实验动物中心提供的昆明种小鼠32只,体质量16～23 g,雌雄各半。正常饲养1周后按随机数字表法分为空白组、哮喘模型组、TS阳性组、艾炷灸治疗组各8只，雌雄各半。

1.2 主要试剂与仪器

超声雾化器980型、AS620型冰冻切片机、MaticB5型双目生物显微镜、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、卵清白蛋白OVA、一氧化氮(NO)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、TS雾化液、精制艾绒。艾炷制备： “热敏灸条”中艾绒制作成直径为3 mm、高4 mm、重约13～15 mg的圆锥体艾炷；TS雾化液制备：TS液2.5 mg加入1 ml生理盐水。

1.3 小鼠哮喘模型复制

第1、8、15天分别给哮喘模型组、TS阳性组、艾炷灸治疗组每只小鼠腹腔注射抗原液0.5 mL以致敏，空白组用生理盐水代替，每日1次。从第16天开始，将哮喘模型组、TS阳性组、艾炷灸治疗组小鼠分别置于25 cm×15 cm×15 cm密闭玻璃容器内，给予1%OVA引喘液恒压超声雾化吸入激发。空白组以等量生理盐水进行雾化激发，每日1次，每次雾化吸入20 min共14d。

1.4 治疗方法

从第16天起每次雾化前30 min做治疗。艾炷灸治疗：用固定夹将小鼠固定后参照李辞蓉等著的《小鼠针灸穴位图谱的研制》标准及拟人比照法进行穴位定位。艾炷施灸方法: 先将施灸部位的体毛剪去,再涂以少量芦荟汁放上艾炷, 采用无瘢痕直接灸,每穴3壮，每日1次，每壮以小鼠全身挣扎为度。艾炷灸治疗组分别于第17、19、21、23、25、27、29天奇数天艾炷灸中脘、膻中。偶数天从第16天至第30天艾炷炷灸双肺腧。TS阳性组治疗：TS溶液雾化治疗，每日1次，每次雾化20 min共14 d。空白对照组：哮喘模型组第16天开始介入，以生理盐水代替雾化治疗，每日1次，每次雾化20 min共14 d。

1.5 血清SOD、MDA、NO检测

第30天(末次雾化激发24 h后)将各组小鼠眼球取血2 mL,然后以3 000 r/min的速度离心10 min取血清，放置低温冰箱中备用。SOD、MDA、NO检测方法按照说明书进行。

1.6 病理切片

处死小鼠，用磷酸盐缓冲液经支气管灌注后取下右肺叶，以10%福尔马林固定24 h后作病理切片，行HE染色作病理观察。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠行为学观察

空白组：吸入生理盐水雾化液后小鼠开始有轻度搔鼻抓面等举动，个别小鼠有喷嚏现象，但无咳嗽、气促等症状，3～5 min后逐渐适应，上述表现全部消失，活动虽减少但呼吸平稳，神态安定，无任何呼吸道症状。激发过后小鼠迅速恢复活动且活动敏捷，食量正常，体质量增加，毛色光泽。哮喘模型组: 小鼠在吸入1%OVA30 s～1 min后即出现明显烦躁不安，不停搔抓鼻面及全身，喷嚏、咳嗽继而活动减少，拱背蜷卧，呼吸急促、深快，腹部收缩凹陷，鼻部、唇周皮肤发绀、舌质紫黯等。部分小鼠出现呼吸不规则，反复激发后上述症状逐渐加重。激发过后精神较差，食量减少，体质量增长速度减慢，毛发欠光泽。其余各给药组小鼠在激发时也出现搔抓鼻面、喷嚏、咳嗽及呼吸增快、腹部收缩等症状，但持续时间短，频率和程度均较轻；TS阳性组: 出现食量减少，逐渐消瘦，体质量下降，少量脱毛且毛发欠光润，激发时烦躁多动，口唇、鼻周见轻度紫绀等症状；艾炷灸治疗组：小鼠吸入OVA后其表现未见紫绀及烦躁不安等症状，激发过后精神、活动、食量、体质量及毛发无明显异常。

2.2 肺组织病理形态学观察

空白对照组(见图1)：小鼠肺组织中肺泡壁薄，肺泡的大小均一，肺泡腔内无任何分泌物渗出，肺泡的间隔无增宽，肺无萎陷及血管壁增厚，支气管黏膜皱壁无任何破坏，支气管壁及其周围无炎性细胞浸润和分泌物；哮喘模型组：肺泡壁结构被破坏，显著的炎症变化，肺泡腔内渗出物明显增多，支气管收缩，管壁黏膜下水肿，支气管黏膜上皮局部脱落，基底膜增厚，玻璃样变性，杯状细胞增生，支气管周围血管扩张、充血，管壁各层明显的嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞浸润；TS阳性组：TS阳性组轻度炎症变化，相较于哮喘模型组其炎性细胞浸润明显减轻，黏液减少，肺泡结构及支气管黏膜完整，部分仍有轻微破坏。但总体来说，TS阳性组病变范围、程度均较模型组减轻；艾炷灸治疗组：支气管结构基本正常，个别黏膜细胞变性及坏死，支气管腔内未见明显炎性渗出物，管腔周围有少量淋巴细胞、巨噬细胞浸润；肺泡壁轻度增宽，毛细血管扩张充血明显减轻，肺泡壁少量淋巴细胞、巨噬细胞浸润，肺泡腔内未见炎性渗出物。组织学改变与TS阳性组类似，与哮喘模型组比较炎症程度明显减轻。

图1 各组小鼠肺组织病理切片(×500)

2.3 各组小鼠血清MDA、SOD、NO水平比较

表1显示，哮喘模型组与空白组比较，血清MDA、NO水平显著增高(P<0.05)，血清SOD活性显著降低(P<0.01)；TS阳性组和艾炷灸治疗组与哮喘模型组比较，血清MDA、NO水平显著降低(P<0.01)，血清SOD活性显著升高(P<0.05，P<0.01)；TS阳性组血清MDA、SOD、NO水平与艾炷灸治疗组比较差异无统计学意义(P>0.05)；艾炷灸治疗组与空白组血清MDA、SOD、NO水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组小鼠血清MDA、SOD、NO水平比较

注：与空白组比较：#P<0.05,##P<0.01;与哮喘模型组比较：*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

本研究发现，哮喘模型组哮喘血清SOD水平显著降低,MDA水平显著增高，说明哮喘小鼠体内氧自由基增多，清除氧自由基的SOD减少，生成的脂质过氧化物MDA增加。国内学者研究证实，在哮喘发作过程中给予抗氧化剂可以明显改善哮喘临床症状，缩短病程[3]。本实验结果显示，模型组小鼠肺组织SOD活性显著下降而MDA水平显著增加，说明小鼠体内产生了大量氧自由基，与近年来有关氧自由基在哮喘中作用的报道相一致[4]。经过艾炷灸干预后，艾灸组小鼠血清SOD活性升高，MDA水平降低，与正常组比较差异无统计学意义，基本恢复正常活性。说明艾炷灸可以提高哮喘小鼠体内SOD活性，增强抗氧化能力，对体内产生的过量氧自由基有清除作用。

NO对淋巴细胞增生有抑制作用，并发挥其抗炎作用[5]。但如果气道组织中的iNOS不断被激活，其合成并释放出大量的NO刺激呼吸道毛细血管后静脉浆细胞，致使浆细胞的渗出物增多，上皮细胞大量脱落，功能结构变性，导致细胞最终死亡，从而使炎症反应更为严重，气道反应性明显增高，哮喘症状则加速恶化[6]。Ward等[7]通过研究发现，NO供体可抑制乙酞胆碱、组胺、白三烯D4所致的气道收缩，NOS抑制剂L- NAME可减弱由于冷空气、运动所引起的气道收缩，但不影响乙酰胆碱释放，提示NO对乙酞胆碱收缩气道平滑肌起着对抗作用。正常情况下，cNOS来源的NO可以松弛各个气管的气道平滑肌，对气道平滑肌张力的正常生理调节发挥着重要作用。当哮喘时，源于cNOS生成而来的NO不足，气道上的非肾上腺素能非胆碱能神经功能发挥失常，导致iNOS活性增强，局部气管组织周围产生大量的NO，一旦气道组织受损立即诱发气道高反应性。本研究发现，哮喘模型组血清NO水平浓度显著高于空白组，说明哮喘模型组小鼠血清及气道平滑肌周围产生大量NO，并诱发气道高反应，符合哮喘发病的重要特征。经TS及艾炷灸治疗后哮喘小鼠血清NO大幅下降，与哮喘模型组比较差异显著。上述研究表明，艾炷灸与TS一样具有抑制炎症、缓解控制哮喘发作的功效，提示艾炷灸抗气道炎症的作用机制与气道高反应密切相关。由此可知，艾炷灸可以抗氧化，清除哮喘模型体内自由基，使之免受哮喘发病过程中脂质过氧化物的损伤。

〔1〕 王永炎.中医内科学[M].上海:上海科学技术出版社,1997:62- 68.

〔2〕 唐照亮,宋小鸽,章复清,等.艾灸抗炎免疫作用机制的实验研究[J].安徽中医学院学报,2003,22(2):35.

〔3〕 符州,等.大剂量维生素C、E治疗哮喘[J].实用儿科临床杂志，1997,12 (6):384- 385.

〔4〕 杜捷夫,等.哮喘患者及豚鼠模型血浆肺组织内皮素- 1测定及亚硝基左旋精胺酸甲酷的影响[J].中华结核和呼吸杂志,1998, 21 (5):293- 296.

〔5〕 王水利.一氧化氮在哮喘发病中的作用[J].医学综述,2000,6(4):162.

〔6〕 杜捷夫.一氧化氮在支气管哮喘发病及治疗中的作用[J].国外医学:内科学分册,1996,23(8):330.

〔7〕 SILKOFF PE, ERZURUM SC, LUNDBERG JO, et al.ATS Workshop proceedings: exhaled nitric oxide and nitric oxideoxidative metabolism inexhaled breath condensate[J].Proc Amthorac Soc,2006,3(2): 131- 145.

Study on the Curing Mechanism of the Airway Inflammation with Moxa Cone Moxibustion in Murine of Asthma

XIE Ling- ling, LI Ping- chun, PAN Feng- xia, ZHU Bei- sheng, LI Mei

(The Department of rehabilitation medicine, People’s Hospital of Chongzuo,Guangxi,Chongzuo 533200,China)

Objective: To observe the effective of moxa cone moxibustion on serum superoxide dismutase activity, nitric oxide and malondialdehyde in rats with asthma in order to explore its possible effective mechanism during the process of cure the asthma.Methods: Thirty- two rats were randomly divided into control group, asthma model group, moxibustion treatment group, terbutaline sulfate positive group and blank group with saline intraperitoneal injection and aerosol inhalation, the other groups were given intraperitoneal injection of ovalbumin sensitization and inhalation asthma, after the success of modeling respectively. Using saline atomization, atomization, TS moxibustion treatment, measured two weeks after the mice serum MDA, SOD, NO, lung morphology observation;Results: Compared with the control group, asthma model group serum MDA, NO levels increased significantly; Compared with the asthma model group, TS positive group, moxibustion treatment group MDA was significantly lower. Compared with the control group, asthma model group serum SOD levels were significantly reduced;Compared with the asthma model group, TS positive group, Moxibustion treatment group the level of SOD was significantly increased; Conclusions: Moxa cone moxibustion can increase the activity of SOD in serum of mice, decrease NO, MDA level, therefore, possible mechanism of moxa cone moxibustion on asthma and decrease the NO, MDA levels, increased SOD activity.

Asthma; Moxa cone moxibustion; Airway inflammation; Antioxidant

谢玲玲(1987-)，女，广西崇左人，主治医师，医学硕士，从事针灸防治哮喘的临床与研究。

R245.81

B

1006- 3250(2017)07- 0992- 03

2017- 01- 11