基于JAK2/STAT3信号通路探讨风湿宁胶囊对寒湿痹阻型类风湿关节炎的作用机制❋

王永辉，张晓园，李艳彦，周 然

(1. 山西中医学院，山西 晋中 030619； 2. 山西省中医院，太原 030012)

【实验研究】

基于JAK2/STAT3信号通路探讨风湿宁胶囊对寒湿痹阻型类风湿关节炎的作用机制❋

王永辉1，张晓园2，李艳彦1，周 然1

(1. 山西中医学院，山西 晋中 030619； 2. 山西省中医院，太原 030012)

目的：探讨风湿宁胶囊对寒湿痹阻型类风湿关节炎模型大鼠JAK2/STAT3信号通路的影响及作用机制。方法：SD大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、tofacitinib组(15mg·kg-1)和风湿宁高、中、低剂量组(1.32，0.66，0.33 g·kg-1)每组各12只；除正常组外，其余各组大鼠均采用人工气候箱模拟寒湿环境结合II型胶原诱导的方法制备寒湿痹阻型类风湿关节炎大鼠模型，造模成功后，各组大鼠灌胃给予相应药物进行干预，每日1次，连续28 d；观察药物对大鼠关节肿胀度、关节滑膜组织JAK2、STAT3及JAK2/STAT3通路负反馈抑制因子SOCS3的mRNA和蛋白表达情况。结果：风湿宁胶囊可显著降低寒湿痹阻型类风湿关节炎模型大鼠的关节肿胀度，抑制JAK2、STAT3 mRNA及蛋白的过表达，促进SOCS3 mRNA及蛋白表达。结论: 风湿宁胶囊抑制JAK2/STAT3信号通路的过度激活作用是其治疗类风湿关节炎的重要机制之一。

风湿宁胶囊；类风湿关节炎；寒湿痹阻；JAK2/STAT3信号通路

类风湿关节炎(RA)是一种以多关节滑膜炎症为主要表现的系统性、自身免疫性疾病[1]，其病变主要影响外周关节，也可累及皮肤、心脏、肺、眼睛等其他组织和器官。RA在我国的发病率为0.32%～0.38%，疾病早期主要表现为关节肿胀、疼痛及进行性关节软骨和骨的破坏，若不及时治疗最终会导致关节畸形、功能丧失，有很高的致残率，给患者及社会带来了沉重的经济负担[2]。

虽然遗传、环境及免疫系统紊乱等多种因素均可诱发RA，但其发病原因及机制至今尚不明确。因此，针对RA发病机理的研究和寻找新的治疗靶点是风湿病学界的一项重要课题。近年来RA的发生被证明，与体内多种炎性因子、趋化因子和基质降解分子密切相关，正是这些因子引发了对关节腔的持续侵袭，最终造成关节损伤。JAK2/STAT3信号通路因广泛参与RA患者关节滑膜细胞的增殖、凋亡、炎症反应、血管翳形成和机体免疫调节等过程，已成为国内外学者研究的热点[3]。本研究建立了寒湿痹阻型类风湿关节炎大鼠模型，观察了风湿宁胶囊对其关节肿胀度及滑膜组织中JAK2/STAT3通路相关蛋白的影响，从JAK2/STAT3信号通路角度探讨了风湿宁胶囊治疗类风湿关节炎的作用机制。

1 材料

1.1 药品与试剂

风湿宁胶囊，山西仁源堂药业有限公司(20150314)；完全弗氏佐剂，美国Sigma公司(F5881)；II型胶原，美国Chondrex公司(100028)；tofacitinib，美国Selleck公司中国分公司(S5001)；Anti- JAK2 antibody，美国abcam公司(ab32101)；Anti- STAT3 antibody，美国abcam公司(ab119352)；Anti- SOCS3 antibody，美国abcam公司(ab16030)。

1.2 仪器

PCR扩增仪，BIO公司；StepOne荧光定量PCR仪，ABI公司；LRH- 800- GSI人工气候箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司；IX51光学显微镜，日本奥林巴斯有限公司；凝胶成像系统，上海复日科技有限公司；TU- 1901紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；LXJ- II离心机，上海医用分析仪器厂；DHP- 9612恒温培育箱，上海一恒科技有限公司；AC8洗板机，芬兰Thermo Labsystems公司；PPTHK- 21B摊片机，徕克公司；CM1850冷冻切片机，徕克公司； HC- 2518R高速冷冻离心机，安徽中科中佳仪器有限公司；DYY- 6C电泳仪，北京六一仪器厂。

1.3 实验动物

SPF级雄性SD大鼠72只，8周龄，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物有限公司(合格证号SCXK- (京)2012- 0001)。

2 方法

2.1 分组、模型制备及给药

适应性饲养1周后，将大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、tofacitinib组(15 mg·kg-1)和风湿宁高、中、低剂量组(1.32，0.66，0.33 g·kg-1)6组。造模当日，除正常组外将其余各组大鼠置气候箱中模拟寒湿环境[RH=(90±4)%，T=(6±2)℃]持续刺激8 h，每日1次，连续14 d；造模第7天，除正常组外其余各组大鼠均于右后肢足爪、尾根、背部各注射Ⅱ型胶原乳液(1 mg·mL-1)0.1 mL，正常组大鼠于相同部位皮下注射等量生理盐水；造模第14天同法免疫加强1次，以制备寒湿痹阻型类风湿关节炎大鼠动物模型。次日开始给药干预(记为1 d)，各组大鼠分别灌胃相应药物，正常组、模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，每日1次，连续28 d。

2.2 指标检测

表1显示，从第1天开始，每7 d采用容积法检测各组大鼠右后肢容积，按下列计算关节肿胀度：肿胀度=(造模前容积-造模后容积)/造模前容积×100%。于末次给药24 h后处死大鼠，取右踝关节滑膜组织，分别采用免疫荧光和Western blot法检测滑膜中JAK2、STAT3和SOCS3蛋白的表达水平，采用Real time- PCR法对滑膜组织中JAK2、STAT3及SOCS3 mRNA表达水平进行检测，结果分析采用2- △△CT法。

表1 JAK2、STAT3及SOCS3基因PCR 引物序列和反应条件

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 风湿宁对大鼠关节肿胀度的影响

表1显示，在整个给药周期中，模型组大鼠关节肿胀度较正常组显著升高(P<0.05)；自给药第14天起，风湿宁高、中剂量组大鼠关节肿胀度较模型组显著降低(P<0.05)，至第28天，风湿宁各剂量组大鼠关节肿胀度均较模型组显著降低(P<0.05)，其中高、中剂量组抗关节肿胀作用明显优于低剂量组(P<0.05)，但高、中剂量组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 风湿宁对大鼠关节肿胀度的影响

注：与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05；与风湿宁低剂量组比较：△P<0.05

3.2 风湿宁对大鼠关节滑膜JAK2、STAT3及SOCS3 mRNA表达的影响

表2显示，与正常组比较，模型组和风湿宁各剂量组大鼠滑膜组织中JAK2、STAT3和SOCS3 mRNA表达均显著升高(P<0.05)；tofacitinib组JAK2、SOCS3 mRNA表达显著降低(P<0.05)，但STAT3 mRNA的表达未见明显改变(P>0.05)；与模型组比较，tofacitinib组、风湿宁高、中剂量组JAK2 mRNA表达显著降低(P<0.05)；风湿宁高剂量组STAT3 mRNA表达显著降低(P<0.05)，风湿宁各剂量组SOCS3 mRNA表达显著升高(P<0.05)，tofacitinib组中SOCS3 mRNA的表达显著降低(P<0.05)。

3.3 风湿宁对大鼠关节滑膜JAK2、STAT3及SOCS3蛋白表达的影响

表2图1显示，与正常组比较，模型组和风湿宁各剂量组大鼠滑膜组织JAK2、STAT3和SOCS3蛋白的表达显著升高(P<0.05)；tofacitinib组JAK2、SOCS3蛋白的表达显著下降(P<0.05)，而STAT3蛋白的表达未见明显改变(P>0.05)。与模型组比较，tofacitinib组、风湿宁高、中剂量组JAK2蛋白的含量显著降低(P<0.05)；tofacitinib组、风湿宁高剂量组STAT3蛋白的表达显著降低(P<0.05)，风湿宁各剂量组SOCS3蛋白含量均有不同程度的升高(P<0.05)，但各剂量组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，tofacitinib组中SOCS3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。

表2 风湿宁对大鼠关节滑膜JAK2、STAT3、SOCS3 mRNA及蛋白表达的影响

注：与正常组比较:*P<0.05；与模型组比较:#P<0.05；与风湿宁低剂量组比较:△P<0.05

图1 风湿宁对大鼠关节滑膜JAK2、STAT3、SOCS3蛋白表达的影响注：从左至右依次为正常组、模型组、tofacitinib组、风湿宁高、中、低剂量组

3.4 风湿宁对大鼠关节滑膜JAK2、STAT3蛋白免疫荧光表达的影响

图2、3显示，与正常组比较，模型组大鼠滑膜组织中JAK2和STAT3蛋白表达显著增多，tofacitinib组中JAK2和STAT3表达明显降低，风湿宁高、中剂量组JAK2和STAT3蛋白表达有不同程度的降低。

图2 风湿宁对大鼠关节滑膜JAK2免疫荧光表达的影响(100×)

图3 风湿宁对大鼠关节滑膜STAT3免疫荧光表达的影响(100×)

4 讨论

类风湿关节炎属于中医“痹症”范畴。《素问·痹论》曰：“风、寒、湿三气杂至，合而为痹也。”在“三气致痹学说”中，寒、湿二邪尤为重要，寒性收引凝滞，客于经脉，气血为其所痹阻，表现为关节冷痛；湿性重浊黏滞，阻碍气血运行，表现为肢体疼痛重着，寒湿相杂，病情多缠绵难愈。现代医学认为，JAK/STAT信号通路是介导与 RA 发病有关细胞因子传导的重要途径，由其所介导并引发的炎症级联放大效应是RA致病的关键[4]。JAK有4个家族成员，其中JAK3仅在骨髓、淋巴系统中表达，JAK1、JAK2和TYK2则广泛分布于机体的细胞和组织中[5]。STAT位于JAK下游，是信号传导及转录激活因子，JAK使其磷酸化后形成二聚体而激活，活化的STAT二聚体转移到细胞核内与相应的靶基因启动子结合后，进而激活基因转录和表达[6]。SOCS是JAK/STAT信号通路的自身负反馈调节因子[7]，由其介导的负反馈调节可抑制因JAK/STAT信号通路持续开放而造成的细胞代谢失调和功能紊乱。RA患者滑膜组织中JAK2、STAT3呈高表达状态[8]，其中，STAT3的激活仅存在于RA患者的滑膜组织中，而在一般关节炎患者的滑膜组织中表达极低[9]。在RA的发生发展过程中，滑膜细胞中STAT3的持续表达是引发滑膜炎症的主要因素之一。IL- 6、IL- 10和IFNs都可使STAT3激活，从而抑制成纤维滑膜细胞的凋亡，并增加T淋巴细胞的活性，进一步加重类风湿的临床症状[10-11]。基因靶向研究已表明，SOCS3具有对抗IL- 6/STAT3 的作用[12]。

风湿宁胶囊具有祛风散寒、除湿通络、活血止痛之功，主治风寒湿兼瘀血阻络型痹症。自20世纪80年代起，风湿宁胶囊以医院制剂的形式来治疗类风湿性疾病，经过多年的临床应用证明，其对类风湿关节炎的有效率可达90.8%，可明显改善患者的临床症状，延缓或阻止病情的继续发展[13]。JAK/STAT信号通路是一条由多种细胞因子受体刺激的信号传导通路，IL- 6、IL- 17、IL- 21和IFNα/β等多种因子可通过不同途径激活 JAK/STAT 信号通路[14]。前期研究表明，风湿宁胶囊具有改善机体免疫失衡、调节炎性与抗炎细胞因子比例等作用，能够显著降低外周血Th17 细胞比率，减少IL- 1β、IL- 4、IL- 6、IL- 10、IL- 17A、TNF- α、IFN- γ等炎性因子的分泌[15-16]。本研究进一步观察了风湿宁胶囊对寒湿痹阻型类风湿关节炎模型大鼠JAK2/STAT3信号通路的影响。实验发现, 与正常组比较，模型组大鼠关节滑膜中JAK2、STAT3的mRNA和蛋白表达均显著增加。风湿宁胶囊可促进大鼠滑膜组织中JAK2/STAT3信号通路负反馈调节因子SOCS3 mRNA和蛋白的表达，抑制JAK2、STAT3 mRNA和蛋白的过表达，表现出对JAK2/STAT3通路过度激活状态的抑制效应。综上所述，风湿宁胶囊抑制JAK2/STAT3信号通路的过度激活作用是其治疗类风湿关节炎的重要机制之一。

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Functional Mechanism of Fengshining Capsule on the Cold Dampness Blockage Type of Rheumatoid Arthritis Based on the Jak2/Stat3 Signaling Pathway

WANG Yong- hui1, ZHANG Xiao- yuan2, LI Yan- yan1, ZHOU Ran1

(1. Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Shanxi Jinzhong 030619,China; 2. Shanxi Provincial Hospital of traditional Chinese Medicine， Taiyuan 030012,China)

Objective: Investigating the effects and mechanism of Fengshining capsules (FSN) on CIA (Type of Cold dampness Blocked in Joints, CDM) rats model via JAK2 / STAT3 signal pathway. Method: SD rats were randomly divided into 6 groups, each group of 12, using artificial climate chamber simulated cold- dampness environment and type II collagen induced CWM rats model，and treated by FSN (1.32,0.66,0.33 g · kg-1),1times daily, for 28 consecutive days. Observed rats ankle swelling, mRNA and protein expression of JAK2, STAT3 and SOCS3 in synovial tissue. Results：FSN can effectively reduce the CWM rats ankle swelling degree, reduced mRNA and protein expression of JAK2 and STAT3, promoted the mRNA and protein expression of SOCS3. Conclusion: FSN has obvious therapeutic effect on CWM rats model, the mechanism was related to inhibitory action on the excessive activation of JAK2/STAT3 signal pathway.

Fengshining Capsules; CIA rats; Type of Cold dampness Blocked in Joints; JAK2/STAT3 signal pathway

国家自然科学基金面上项目(81473589)-基于JAK- STAT信号转导通路利用蛋白组学技术从方病证相关角度研究风湿宁胶囊治疗类风湿关节炎的作用机制

王永辉(1974- )，男，山西忻州人，副教授，医学博士，从事方药功用物质基础与药理作用研究。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0949- 04

2017- 02- 14