针药结合对脑缺血再灌注损伤大鼠MPO、ICAM-1和IL-lβ的影响

张玉红,马玲，白荷

(1.巩义瑞康医院，河南 郑州 451200;2.郑州大学附属郑州中心医院，河南 郑州 450003; 3.河南汉钧文化传播有限公司，河南 郑州 450009)

针药结合对脑缺血再灌注损伤大鼠MPO、ICAM-1和IL-lβ的影响

张玉红1,马玲2，白荷3

(1.巩义瑞康医院，河南 郑州 451200;2.郑州大学附属郑州中心医院，河南 郑州 450003; 3.河南汉钧文化传播有限公司，河南 郑州 450009)

目的：研究五神针(针刺百会、四神聪穴)结合不同剂量的当归四逆汤加减对大鼠脑缺血再灌注后脑组织髓过氧化物酶(MPO)活性、黏附分子-1(ICAM-1)及白细胞介素-1β(IL-1β)表达的影响。方法：将108只SD大鼠随机分假手术组、模型组、尼莫地平片组、针药低剂量组、针药中剂量组和针药高剂量组，每组再分为3个亚组，每亚组6只。除假手术组外均建立脑缺血再灌注模型，尼莫地平片组采用尼莫地平片干预，针药低剂量组、针药中剂量和针药高剂量组分别采用五神针结合低剂量、中剂量和高剂量当归四逆汤加减进行干预，模型组和假手术组给予等量的生理盐水。采用运动功能检测法评估各组大鼠的运动能力；TTC染色法检测各组大鼠脑梗死体积;采用紫外分光光度比色法检测MPO;采用免疫组化法检测脑组织中ICAM-1和IL-1β的表达。结果：尼莫地平片组和针药高剂量组第3 d、5 d与模型组、针药低剂量组和针药中剂量组比较，行为异常均有明显改善(P均<0.05)，脑梗死体积明显减少(P均<0.05)，MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白表达有显著的改善(P均<0.05)，针药高剂量组与尼莫地平片组比较无显著性差异(P>0.05)。 结论：五神针结合高剂量当归四逆汤加减能够明显缩小脑缺血再灌注后的脑梗死体积，减轻运动功能缺损，有效改善MPO活性、ICAM-1和IL-lβ蛋白的表达，对缺血后的脑组织具有保护作用。

五神针；当归四逆汤加减；脑缺血再灌注；髓过氧化物酶；黏附分子-1；白细胞介素-1β

脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury)是脑的血流中断，造成缺血区域缺血缺氧甚至是坏死的病理改变，当再灌注时不但不能恢复脑神经功能反而会加重脑的损伤，即所谓的脑缺血再灌注损伤[1]。目前西医采用抗脑缺血再灌注损伤药物进行治疗[2]，疗效虽好，但副作用较大；中医药对脑缺血再灌注方面的治疗具有独特的优势，能够多途径、多靶点、多向调节的作用于脑损伤部位，安全有效[3-4]。笔者多年来一直致力于针刺结合中药汤剂治疗脑缺血的临床研究，取得了较好的疗效[5-6]。为探索其在治疗脑缺血再灌注疾病的内在机理，笔者研究五神针(针刺百会、四神聪穴)结合不同剂量当归四逆汤加减对大鼠脑缺血再灌注后MPO活性、ICAM-1及IL-1β表达的影响，为临床应用提供实验依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级SD大鼠90只，雌雄各半，体质量(240±18)g，由河南中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK(豫)2010002。按照随机数字表法随机分为6组：假手术组、模型组、尼莫地平片组、针药低剂量组、针药中低剂量组和针药高剂量组，每组18只；每组再分为3个亚组，每亚组6只。

1.2 试验仪器和试剂

JD-PT型动物实验跑台(上海继德教学实验器械厂)；XJ80-2型医用离心机(金坛市恒丰仪器厂)；1141002型号凝胶拍照仪(美国Wealtec公司)；免疫组化用试剂盒(北京中山生物技术有限公司)；尼龙线栓(线头直径(0.32±0.02)mm，北京沙东生物技术公司)；QR-3268型石蜡切片机(美国AO型转轮式切片机)；华佗牌针(苏州医疗用品厂有限公司，规格为0.18 mm×25 mm，批号GB2024-1994)；尼莫地平片(山东明仁福瑞达制药股份有限公司，批号H37022797)；3%戊巴比妥(湖北武汉，批号302-17-0)；所有中药饮片均来自河南中医药大学第三附属医院。

1.3 模型制备

造模前各组大鼠连续灌胃15 d，禁食1 d。模型组、尼莫地平片组、针药低剂量组、针药中剂量组、针药高剂量组的大鼠给予3%戊巴比妥(38 mg/kg)腹腔注射麻醉，然后仰卧固定，常规备皮消毒，颈中切口，从肌群间向深部分离暴露其颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)，分别近心端挂线结扎，微动脉夹暂时夹闭近心端距颈总动脉分叉处5 mm处，眼科剪45°在CCA远端上剪一小口，将制备好的线栓沿切口插入，将预先置于颈内动脉上的挂线适度系住防止出血，后移去微动脉夹，用眼科镊缓慢推进线栓，使线栓头端通过CCA分叉进入ICA时将栓线弧度调整为右下方，遇阻力停止，即达大脑中动脉起始部，完全阻断其血流，插入深度自CCA分叉处16～18 mm，将先前的挂线扎紧固定栓线，然后缝合肌肉皮肤，栓线尾端外露部分标记，缺血达到2 h后小心外拉栓线约1 cm使其球端回至CCA内，即形成再灌注，在缺血期间及再灌注后保持正常体温，间隔抽吸气道分泌物使呼吸道保持通畅。假手术组大鼠经同样麻醉后只分离血管，结扎。

1.4 干预方法

1.4.1 尼莫地平片组

剂量为0.126 g/kg，使用前加蒸馏水按1 g/L配制成混悬液,每日3次。

1.4.2 针药组

在造模后24 h，同时给予五神针结合当归四逆汤加减进行治疗。针刺穴位定位方法依据《实验针灸学》[7]，百会，四神聪(百会穴前、后、左、右各开2 mm，共4个穴位)。百会针刺手法：采用平补平泻手法，捻转持续1 min，留针20 min。四神聪针刺手法：采用平刺手法，得气后用捻转补法，留针20 min。每日1次，6天为1个疗程，疗程间休息1日，连续治疗4个疗程。在针刺同时给予当归四逆汤加减进行治疗。组方:当归20 g，熟地黄15 g，川芎10 g，桂枝10 g，牛膝10 g，赤芍10 g，细辛3 g，大枣 6枚，炙甘草6 g。水煎煮，给药剂量为低剂量组10.96 g/kg，中剂量组21.92 g/kg，32.88 g/kg，早中晚各1次。

1.4.3 模型组和假手术组

给予等量的生理盐水。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 运动功能检测[8]

分别于造模后1 d、3 d、5 d进行网评试验,检测大鼠运动功能。大鼠可持续抓住网屏5 s，未滑落，计0分；大鼠可持续抓住网屏，有滑落但5 s内未掉下，计1分；大鼠抓住网屏5 s内掉下，计2分；网屏转动过程中大鼠掉下，计3分。

1.5.2 脑梗死范围的测定

运动功能检测后，采用TTC染色法进行脑梗死范围测定。快速断头取脑，去除小脑及低位脑干，余下部分置于-20℃冰箱内冷冻15 min，从前额极向后行冠状位切片后，浸入2%TTC磷酸盐缓冲液中，水浴箱中染色30 min。将染色后的脑组织放入多聚甲醛中固定24 h，数码相机拍照后，计算脑梗死体积。脑组织非缺血部分呈现红色，缺血部分呈现白色。应用image J2X图片分析软件计算各切片组织的脑梗死面积，然后根据公式计算出脑梗死的体积，计算公式为：v=(A1+…+An)t/2，t表示切片厚度，A表示梗死面积，最后算出脑梗死灶体积百分比。

1.5.3 脑组织MPO活性的测定

将脑组织从-70℃冰箱内取出、解冻、称重，以试剂盒所提供的试剂配制成匀浆介质；按重量体积比为1∶19加匀浆介质制备成5%的组织匀浆；其余操作按试剂盒步骤进行；取出后在紫色分光光度计460 nm处，测定吸光度值。根据公式计算各脑组织的MPO值：MPO(单位/克湿片)=(测定管OD值-对照管OD值)/11.3×取样量(g)。其中11.3为斜率的倒数，取样量为所含组织湿片的量。

1.5.4 免疫组化法检测脑组织ICAM-1和IL-lβ蛋白表达水平

从4%多聚甲醛中取出脑组织，蒸馏水浸泡2 h，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规脱蜡等同HE染色。石蜡切片脱蜡至水：二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min，100%酒精Ⅰ10 min，100%酒精Ⅱ10 min，95%酒精Ⅰ5 min，95%酒精Ⅱ5 min，80%酒精5 min，蒸馏水冲洗3 min×3次。3% H2O2孵育5～10 min，以灭活内源性过氧化物酶。 蒸馏水水洗3 min×3次。抗原修复：将切片浸入0.01 M枸橼酸盐缓冲液(pH值6.0)，微波炉中加热至沸腾5～10 min后，冷却至室温。再重复进行一次。 PBS缓冲液(pH值7.2)冲洗2 min×3次。擦干周围的PBS液，不洗，滴加5%BSA(正常山羊血清)，室温封闭20 min，滴加1∶100比例稀释的兔抗大鼠IL-1β，然后放入4℃冰箱内过夜。从冰箱内取出，PBS缓冲液冲洗2 min×3次。 擦干周围的PBS液后，滴加山羊抗兔二抗IgG，置于室温(37℃)20 min。PBS缓冲液冲洗2 min×3次。加试剂SABC:滴加稀释的链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合素(SABC)，室温孵育20 min。PBS缓冲液冲洗5 min×4次。加DAB显色剂：使用DAB显色试剂盒。在1 ml蒸馏水中加试剂盒中的A、B各1滴，摇匀后加至切片,室温中显色。蒸馏水冲洗显色的片子5 min，浸于苏木精中复染。蒸馏水冲洗复染后的片子后，将载玻片放入70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ酒精及二甲苯Ⅰ、Ⅱ中，每个试剂放2 min。浸泡在二甲苯中，搬通风柜中。光学显微镜下，以细胞浆内出现的棕黄色颗粒者为阳性细胞。光镜下，每张切片随机观察5个不同的视野，计算平均阳性细胞率。

平均阳性细胞率(%)=阳性细胞数/计数细胞总数×100%

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 运动功能评分情况比较

假手术组未出现明显的运动功能异常；模型组、尼莫地平片组、针药低剂量组、针药中剂量组和针药高组大鼠第1 d均出现严重的运动功能缺损的表现；尼莫地平片组和针药高剂量组第3 d、5 d与模型组比较，行为异常均有明显的改善(P<0.01)，与针药低剂量组和针药中剂量组比较，行为异常均有明显的改善(P<0.05)，针药高剂量组与尼莫地平片组比较无显著差异(P>0.05)。结果见表1。

表1 各组运动功能评分比较

注：与假手术组同期比较，*P<0.01；与模型组同期比较，△P<0.05；与尼莫地平片同期比较，▲P>0.05。

2.2 脑梗死体积情况比较

假手术组未出现明显体积的脑梗死；模型组、尼莫地平片组、针药低剂量组、针药中剂量组和针药高剂量组大鼠第1 d均出现大面积的脑梗死的表现；尼莫地平片组和针药高剂量组第3 d、5 d与模型组、针药低剂量组和针药中剂量组比较，脑梗死体积均有明显的减少(P<0.01)，针药高剂量组与尼莫地平片组比较无显著差异(P>0.05)。结果见表2。

表2 各组脑梗死体积比较

注：与假手术组同期比较，*P<0.01；与模型组同期比较，△P<0.05；与尼莫地平片同期比较，▲P>0.05。

2.3 MPO活性、ICAM-1和IL-lβ的蛋白表达情况比较

假手术组MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白的表达未出现明显的变化；模型组、尼莫地平片组、针药低剂量组、针药中剂量组和针药高剂量组大鼠第1 d均出现MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白表达的明显异常；尼莫地平片组和针药高剂量组第3 d、5 d与模型组、针药低剂量组和针药中剂量组比较，MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白表达均有明显的改善(P<0.01)，针药高剂量组与尼莫地平片组比较无显著差异(P>0.05)。结果见表3，免疫组化图见图1、图2。

表3 各组MPO、ICAM-1和IL-lβ比较

注：与假手术组同期比较，*P<0.01；与模型组同期比较，△P<0.05；与尼莫地平片同期比较，▲P>0.05。

图1 各组大鼠脑缺血再灌注5 d IL-1β蛋白表达比较(免疫组化，×40)

图2 各组大鼠脑缺血再灌注5 d ICAM-1蛋白表达比较(免疫组化，×40)

3 讨论

脑血管病归属于中医学“中风”的范畴，包括缺血性中风和出血性中风[9]。中医学认为风、火、痰、瘀阻于脑络而出现半身不遂、口眼歪斜、半身麻木等临床症状[10]。心、脑、肾、肝缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、心绞痛、心梗都可归属于血行不畅形成的病症[11-12]。各种原因导致的某一器官缺血、缺氧，血流障碍及血流异常而出现的水肿、炎性改变、组织变性等一系列病理改变，都可以概括为血瘀证，应用活血化瘀药物可活其血脉、化其瘀滞[13]。治疗机制主要体现在减轻细胞内钙的超载、抑制炎症反应，减少炎症因子的释放及清除氧自由基等。此外活血化瘀的药物还具有抑制炎症反应、调节免疫功能、抑菌和抗病毒的作用[14]。

西医认为脑缺血再灌注是一个复杂的多因素的通过多种途径导致损伤的病理过程，脑缺血后会出现一个级联反应[15]，如兴奋性氨基酸的释放、酸中毒、过度炎症反应、细胞内离子失衡、细胞内钙超载、自由基的损伤和凋亡细胞基因的激活等，这些因素往往都不是单独存在的，而是相互关联相互重叠，共同造成脑缺血再灌注损伤[16]。

IL-1β对脑神经细胞产生的毒性效应与中医中风毒邪学说有着相似之处。毒邪的生物学基础就是脑缺血再灌注后产生的有害物质，其中炎症因子的过量表达就属于其中一种[17]。炎症因子介导了炎症反应和一系列相关的氧化自由基、兴奋性氨基酸的神经毒和酸中毒等反应，是毒邪损伤脑组织的具体表现形式，这些毒性物质共同作用造成神经细胞的坏死和凋亡，导致脑组织的损害[18]。ICAM-1表达是启动白细胞与血管内皮细胞黏附的决定因素。而黏附分子受到炎性细胞因子和炎性介质的刺激过度表达是脑缺血再灌注损伤的始动因素。正常情况下ICAM-1处于低表达或不表达，在刺激因素、动脉硬化、糖尿病、高血压、缺氧及脑缺血再灌注等因素的诱导下，ICAM-1表达明显上调[19]。在脑缺血再灌注时，内皮细胞受损及炎性介质的释放，使各种黏附分子表达明显增加。MPO的活性降低，可减轻对脑组织的损害，脑梗面积缩小以及神经功能不同程度的好转，这些都足以证明针药结合针对炎症反应对脑组织的毒性效应有很好的解毒治疗作用。

针刺对脑血管疾病的治疗具有独特的优势，针刺百会能够调节气血运行，增加脑组织供氧量，改善人和动物的智力功能，保护神经细胞，修复受损神经元[20-21]。四神聪最早源至《银海精微》，针刺四神聪可以益气活血、补脑益智，改善血流变、增加脑组织供氧量，从而促进脑部血液循环。针刺上述穴位具有活血化瘀、益智健脑的功效，可行气活血，扩张脑血管，增加脑组织供氧量，促进神经组织修复，而神经组织功能的恢复和脑部的血液循环密切相关。当归补血汤出自《伤寒论》，原方由熟地黄，当归，桂枝，白芍，细辛，通草，大枣和炙甘草组成，具有温经散寒，养血通脉的功效。以赤芍易白芍祛瘀而不伤正，活血而不破血，药虽平和，疗效尚好;加入川芎辛温香燥，可活血行气，走而不守，能行散，上行可引药人巅顶，直达上部气血；活血应养血和血，忌峻猛克伐，以熟地黄替代通草，补血滋润，益精填髓。诸药共用具有益气活血、健脑益智的功效，能补益气血，促进脑部气血运行，增加脑组织供氧量，修复受损脑组织。

五神针配合高剂量当归补血汤加减可益气活血，改善脑组织血液高凝的状态，扩张脑血管，促进脑组织血液循环，促进脑缺血再灌注， 修复脑组织神经元， 脑髓充盛则脑窍得聪，增强患者的认知和记忆能力，有效改善脑缺血再灌注损伤大鼠MOP、ICAM-1和IL-1β，具有良好的安全性和稳定性，与尼莫地平具有相似的治疗作用。

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河南省中医药科学研究专项课题(No.2014ZY02060)

张玉红(1968-)，女，副主任中医师，主要从事中医药治疗神经系统疾病研究工作。

2017-02-20

修回日期：2017-03-01

R285.5

：A

：1002-2406(2017)05-0037-05