泛素活化酶、端粒酶检测在冠心病心力衰竭患者中的应用价值

崔秀琴，张劢

• 论著 •

泛素活化酶、端粒酶检测在冠心病心力衰竭患者中的应用价值

崔秀琴1，张劢1

目的 分析冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）心力衰竭患者检测胸腹水细胞中泛素活化酶（UBE1）、端粒酶的应用价值。方法 选取2013年1月～2016年1月于新乡市第一人民医院检验科保存的57例胸腹水标本，其中30例为冠心病心力衰竭，15例为冠心病（非心力衰竭，死因为颅脑外伤或机械性损伤），12例正常对照（无心脏病史、无心脏器质性病变、死因为颅脑外伤或机械性损伤）。免疫组化染色检测各组UBE1和端粒酶表达情况。结果 心力衰竭组UBE1免疫组化染色阳性和强阳性比例明显高于冠心病组和正常对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与冠心病组和正常对照组比较，心力衰竭组端粒酶免疫组化染色阳性和强阳性比例明显升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。心力衰竭组UBE1和端粒酶IOD值分别为1201.14（943.19～1672.31）和12 643.81（11 231.07～13 519.31），明显高于冠心病组和正常对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论 冠心病心力衰竭患者胸腹水细胞中泛素活化酶、端粒酶表达明显增强，二者在冠心病心力衰竭诊断中有潜在的应用价值。

泛素活化酶E1；端粒酶；心力衰竭；冠心病

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是由冠状动脉粥样硬化引起，动脉逐渐狭窄导致心脏缺氧和心肌功能障碍。糖尿病、高血压、肥胖等都是该病的诱发因素，另外，冠心病的发作还与大量吸烟和饮酒，情绪激动、饱食、体力活动增加等有关。冠心病治疗不当会发展成心力衰竭。目前临床常用的心肌损伤标志物主要有心肌肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶、脑钠肽等，但均存在一定局限性。因此，寻找能够早期诊断冠心病心力衰竭的生物学指标具有重要意义。研究表明[1,2]，泛素活化酶（UBE1）是广泛存在于胸腹水细胞中的一种蛋白酶，在心力衰竭的早期即被激活，参与胸腹水细胞蛋白质的降解过程，导致胸腹水细胞坏死。端粒酶由催化蛋白与RNA组成，也广泛存在于胸腹水细胞中，其活性与细胞增殖及程序性死亡密切相关[3]。本研究选择UBE1与端粒酶，观察其在冠心病心力衰竭患者胸腹水中的表达变化，以探讨其诊断价值。

1 资料与方法

1.1 选取标本 选取2013年1月～2016年1月于新乡市第一人民医院检验科保存的57例胸腹水标本，其中30例为冠心病心力衰竭，15例冠心病（非心力衰竭，死因为颅脑外伤或机械性损伤），12例正常对照（无心脏病史，无心脏器质性病变，死因为颅脑外伤或机械性损伤）。

1.2 免疫组化检测UBE1和端粒酶表达 将标本制成4 μ m的石蜡切片，置于67℃的烘箱中，脱蜡置水。高压修复抗原后冷却至室温，3%H2O2处理10 min。PBS冲洗3次，每次5 min，加入相应稀释倍数的一抗（分别用淋巴瘤和乳腺癌阳性片做梯度实验，根据结果找出最佳稀释浓度），放入4℃冰箱孵育过夜。PBS冲洗3次，每次5 min。滴加聚合物增强剂，37℃孵育20 min，PBS冲洗3次，每次3 min，滴加酶标二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗4次，每次5 min。DAB镜检显色35 min，自来水冲洗终止显色，苏木精复染，脱水透明，中性树胶封片。UBEI以淋巴瘤阳性片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照；端粒酶用乳腺癌阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。UBEI抗体购自百奇生物科技公司，端粒酶抗体购自北京中山生物公司，二步法试剂盒购自福州迈新生物技术公司。

1.3 判断标准 由2名检验科技师采用双盲法随机选取5个视野，对UBE1和端粒酶的表达进行评分，参照Axiotis标准[4]，阳性细胞数＜10%或染色强度不着色为0分，阳性细胞数在10%～30%或染色强度为淡黄色为1分，阳性细胞数在31%～70%或染色强度为黄色为2分，阳性细胞数超过70%或染色强度为棕黄色为3分。总分=阳性细胞计数+染色强度得分，阴性为0～1分，弱阳性为2分，阳性为3～4分，强阳性为5～6分。图像分析：用Olympus显微镜观察各组切片，选出阳性反应区，随机选5个视野，用Image-Pro Plus6.0图像分析软件对累积光密度（IOD）进行测量，减去IOD背景，剩余值即可反映选定区域蛋白表达量。

1.4 统计学处理 数据处理采用SPSS 20.0软件，偏态分布资料采用M（Q1～Q3）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料采用例数/百分比表示，组间比较采用卡方检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 UBE1在各组的表达比较 心力衰竭组UBE1阳性和强阳性比例明显高于冠心病组和正常对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）（表1）。

2.2 端粒酶在各组的表达比较 与冠心病组和正常对照组比较，心力衰竭组端粒酶阳性和强阳性比例明显升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）（表2）。

2.3 各组UBE 1和端粒酶IOD值比较 心力衰竭组UBE 1和端粒酶IOD值分别为1201.14 （943.19～1672.31）和12 643.81（11 231.07～ 13 519.31），明显高于冠心病组和正常对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）（表3）。

3 讨论

近年来有关心力衰竭早期诊断标记物的研究，主要有两方面，一是胸腹水细胞内蛋白的缺失，二是胸腹水细胞外成分在细胞内的异常表达，但这些研究大部分来源于动物实验，假阳性率较高[5]。急性心肌缺血可导致细胞内蛋白质迅速降解，造成细胞坏死。泛素-蛋白酶体系统是蛋白质降解的重要方式，UBE1是泛素-蛋白酶体系统的关键因素，能够与泛素相结合，从而激活级联的反应，对蛋白质的降解过程产生直接影响[6]。端粒酶能够通过携带的RNA模板，合成端粒DNA添加至细胞染色体末端，填补DNA复制的缺陷，其活性水平的变化可影响细胞的增殖与死亡。大多数人体细胞端粒酶没有活性或活性很低，而冠心病心力衰竭患者胸腹水细胞中却高表达，提示其潜在的应用价值。我们推测UBE1与端粒酶可能参与胸腹水细胞的死亡过程，在冠心病心力衰竭中发挥重要作用。

本研究结果显示，与冠心病组和正常对照组比较，心力衰竭组胸腹水细胞UBE1和端粒酶表达阳性和强阳性比例明显升高，提示胸腹水UBEI和端粒酶表达水平的升高可能为早期冠心病心力衰竭的诊断提供可靠的依据。UBE1广泛存在于胸腹水细胞中[7]，冠心病心力衰竭患者UBE1升高的机制可能为：①在心肌缺血的情况下，低氧诱导因子-1α表达增加，而泛素-蛋白酶体是其主要降解途径，因此，相应上调[8]；②NF-κ B信号通路具有抑制细胞凋亡的作用，而泛素-蛋白酶体系统也参与激活NF-κ B的过程[9]。当心肌缺血导致细胞坏死时，UBE1表达水平上升，启动泛素-蛋白酶体系统，激活NF-κ B信号通路，抑制细胞进一步凋亡[10]。端粒酶在保持基因完整性与细胞增殖能力方面具有重要作用，我们推测，在冠心病心力衰竭初期存活的细胞开始自我修复进程，因此端粒酶被激活，促进血管内皮细胞分裂和增殖，参与组织修复。因此，端粒酶水平升高可能是冠心病心力衰竭早期诊断的敏感指标。

表1 各组UBE1表达情况比较（n，%）

表2 各组端粒酶表达情况比较（n，%）

表3 各组UBE1和端粒酶IOD值比较

综上所述，冠心病心力衰竭患者胸腹水细胞质中UBE1、端粒酶表达明显增强，提示二者均参与了冠心病心力衰竭过程，并在诊断中具有重要潜在价值。

[1] 曲昱蓉. 泛素—蛋白酶体系统对新城疫病毒复制的影响[D]. 中国农业科学院,2014:29-30.

[2] 王娟. 泛素—蛋白酶体相关调节因子CSN5B和OsEIP1的功能分析[D]. 中国农业科学院,2013:109-13.

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本文编辑：姚雪莉

Application values of detection of ubiquitin activating enzyme E1 and telomerase to heart failure of coronary heart disease

Cui Xiuqin*, Zhang Mai.*Department of Clinical Laboratories, First People's Hospital of Xinxiang City, Henan Province, Xinxiang 453000, China.

Objective To analyze the application values of detection of ubiquitin activating enzyme E1 (UBE1) and telomerase in pleural-peritoneal fluid cells in patients with heart failure of coronary heart disease (CHD). Methods The samples of pleural-peritoneal fluid from 57 patients saved in the Department of Clinical Laboratories of the First People’s Hospital of Xinxiang City were chosen from Jan. 2013 to Jan. 2016. All samples were divided into heart failure group (n=30) collected from the patients with grades from Ⅲ to Ⅳ coronary stenosis (excluding other death causes), CHD group (n=15) from the patients with grades from I to Ⅳ coronary stenosis (without heart failure, and death causes being craniocerebral trauma or mechanical injury) and normal control group (n=12) from the patients without heart disease history and cardiac organic lesions, and death causes being craniocerebral trauma or mechanical injury. The expressions of UBE1 and telomerase were detected by using immunohistochemistry staining method in all groups. Results The percentages of UBE1 with positive and strongly positive immunohistochemistry staining were significantly higher in heart failure group than those in CHD group and normal control group (all P<0.05). The percentages of telomerase with positive and strongly positive immunohistochemistry staining increased significantly in heart failure group compared with CHD group and normal control group (all P<0.05). The value of integral optical density (IOD) of UBE1 was 1201.14 (943.19～1672.31) and that of telomerase was 12 643.81 (11 231.07～13 519.31) in heart failure group, which were significantly higher than those in CHD group and normal control group (all P<0.05). Conclusion The expressions of UBE1 and telomerase increase significantly in pleural-peritoneal fluid cells in patients with CHD heart failure, and they have potential application values in diagnosis of CHD heart failure.

Ubiquitin activating enzyme E1; Telomerase; Heart failure; Coronary heart disease

R541.61

A

1674-4055(2017)07-0856-03

1453000 新乡,河南省新乡市第一人民医院检验科

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.07.27