刮痧对正常大鼠局部肥大细胞功能状态的影响*

河北中医学院(石家庄 050200)

潘丽佳 张俊茶 范玺胜 张晓琪 刘 君 邢海娇 张选平 杨延巍 佘延芬

刮痧对正常大鼠局部肥大细胞功能状态的影响*

河北中医学院(石家庄 050200)

潘丽佳 张俊茶 范玺胜 张晓琪 刘 君 邢海娇 张选平 杨延巍 佘延芬

目的：观察刮痧前后局部肥大细胞的功能状态，揭示刮痧疗法的部分作用机制。方法：正常Wistar大鼠随机分为刮痧前组、刮痧后即刻组，刮痧后30 min组、刮痧后60 min组、刮痧后90 min组，每组10只。除刮痧前组外，其余各组均给予刮痧干预，刮拭部位为大鼠背部督脉、两侧膀胱经，刮拭方法为刮法，频次为60次/分，刮拭时间30 s。各组分别于刮痧前、刮痧后即刻、30、60、90 min脱颈处死，于大鼠背部一侧膀胱经上出痧最明显处取材。分别采用甲苯胺蓝染色、免疫组化的方法观察肥大细胞数量以及脱颗粒情况、类胰蛋白酶表达情况。结果：各组肥大细胞数比较差异无显著性，P>0.05；各组肥大细胞脱颗粒率比较差异无显著性，P>0.05；各组类胰蛋白酶阳性细胞数比较差异无显著性，P>0.05。结论：刮痧后以及刮痧后的90 min内肥大细胞的功能状态并未发生明显改变，刮痧即刻未对正常大鼠局部肥大细胞产生影响，推测刮痧疗法的即刻效应与肥大细胞无关。

肥大细胞；刮痧；类胰蛋白酶；大鼠；实验研究

刮痧是应用特制的刮痧工具，在人体体表的腧穴、经络及病变部位进行刮拭，达到防病、治病目的的一种治疗方法，具有方法独特、简便安全、患者易于接受、适应症广、疗效可靠等特点。[1]如今刮痧疗法不仅在国内受到群众的欢迎，在国际上也受到越来越多的关注和应用，而其治疗机理却尚不明确，相关研究也有待进一步深化。[2]皮肤毛细血管、神经末梢丰富，是体表防卫、温度调节的重要器官，刮痧主要通过刺激局部皮肤而发挥作用，刮痧的作用机制复杂与刺激皮肤后通过多种途径发挥作用密切相关。而肥大细胞广泛分布于皮肤及内脏黏膜下的微血管周围，目前许多研究表明，肥大细胞不仅参与肌体过敏、炎症、组织损伤修复、免疫等反应，还与很多生理病理过程有关。[3]在针刺效应机理研究中，肥大细胞的功能状态被认为是针刺起效的关键节点之一，在刮痧的效应机理研究中，肥大细胞的功能作用研究极少，刮痧后穴位处的肥大细胞功能状态是否发生变化，刮痧是否也通过激活肥大细胞发挥效应目前尚不清楚。因此，本研究从刮痧作用于正常大鼠皮肤后的出痧部位入手，观察刮痧后90 min内肥大细胞功能状态的变化以及类胰蛋白酶检测肥大细胞活性变化，探讨肥大细胞在刮痧疗法即刻疗效中的作用机制，以揭示刮痧疗法的部分作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料 选用健康雄性Wistar大鼠50只，体质量(250±20) g，由河北医科大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK(冀)2013-1-003]。所有大鼠实验前适应性饲养1周，不限进食、饮水，自然光照，室温22℃～24℃，相对湿度(50%±5%)。

1.2 主要实验试剂与仪器 肥大细胞类胰蛋白酶鼠单克隆抗体[AA1]，山羊抗小鼠Ig G/HP聚合物，DAB显色试剂盒(20×)，脱毛膏；病理图文分析系统，光学显微镜，冰冻切片机。

1.3 实验分组 采用随机数字表法将动物随机分为5组，根据刮痧后观察时间的不同分为刮痧前组、刮痧后即刻组、刮痧后30 min组、刮痧后60 min组、刮痧后90 min组，每组10只。

1.4 各组干预方 各组大鼠于实验干预前24 h脱毛膏备皮，刮痧前组不给予刮痧干预，但给予同样时间的抓取和固定，其余各组均给予刮痧干预。刮拭部位：大鼠背部督脉、两侧膀胱经，参照《常用实验动物穴位定位图谱》、《腧穴名称与定位》(GB/T12346-2006)结合比较解剖学进行定位，刮拭方法为刮法，手法为平补平泻，刮拭次数为20次，操作方法参照“新世纪全国高等中医药院校创新教材”《刮痧疗法》。刮痧前组、刮痧后即刻组、刮痧后30 min组、刮痧后60 min组、刮痧后90 min组分别于刮痧前，刮痧后即刻、30、60、90 min处死取材。

1.5 标本采集及指标检测方法 各组大鼠干预结束后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，取大鼠背部一侧膀胱经上出痧最明显处体积约为5×5×3 mm3的组织块标本(包括皮肤、肌肉)。

1.5.1 肥大细胞甲苯胺蓝染色：组织块经4%多聚甲醛固定液固定，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，制作连续切片(片厚4 μm)。石蜡切片经脱蜡脱水后，TB溶液染色，冰醋酸液分化，脱水透明后封片。在10×40倍光镜下观察细胞形态。肥大细胞甲苯胺蓝染色特征：成熟肥大细胞呈圆型或卵圆型，轮廓清晰，胞体较大，细胞核常位于细胞中央，胞浆内颗粒被染成紫蓝色，细胞核着色较浅。脱颗粒肥大细胞失去原有形态，细胞轮廓不完整，紫蓝色颗粒游离于细胞外。

计数方法：取2张不连续切片，均在高倍视野(×400)下选取肥大细胞数目最多的5个不重复视野进行计数，记录5个视野细胞总数和脱颗粒细胞数，脱颗粒率=(脱颗粒细胞数/细胞总数)×100%，取2张切片平均值。[4-5]

1.5.2 类胰蛋白酶免疫组化：石蜡切片经脱蜡水化后，用脱蜡修复液(pH 6.0)微波修复抗原，滴加肥大细胞类胰蛋白酶鼠单克隆抗体，冰箱40℃过夜，PBS冲洗后，滴加山羊抗小鼠IgG/HP聚合物，室温孵育30 min，再用PBS冲洗后，DAB显色，苏木素复染，脱水透明后封片。观察结果判定：细胞核和/或细胞浆呈棕黄色或黄褐色为阳性细胞。

计数方法：取2张不连续切片，均在高倍视野(×400)下选取阳性表达最强的5个不重复视野进行计数，取2张切片平均值。[6]

2 结果

2.1 各组大鼠组织中肥大细胞数、肥大细胞脱颗粒率比较 各组大鼠组织中肥大细胞数比较差异无显著性，P>0.05，各组大鼠组织中肥大细胞脱颗粒率比较差异无显著性，P>0.05，详见表1。

表1

各组刮痧前后肥大细胞数、肥大细胞脱颗粒率比较 ±s,n=10)

2.2 各组大鼠组织中类胰蛋白酶阳性细胞数比较 各组大鼠组织中类胰蛋白酶阳性细胞数比较，差异无显著性，P>0.05，详见表2。

表2 各组大鼠组织中类胰蛋白酶阳性细胞数比较 ±s,n=10)

3 讨论

刮痧是中医外治疾病的主要方法之一，使用范围涉及内外妇儿等各科疾病和亚健康状态的防治，且临床疗效十分显著。[7]在刮痧作用机理研究中，Musial F研究团队提出刮痧作为一种反射疗法，可能在伤害感受器和脊髓水平作用于慢性疼痛；在外周可能通过C-纤维，Aδ-纤维连接伤害感受器，在脊髓水平通过脊髓丘脑束上行。[8-9]目前有研究结果显示刮痧可升高局部皮肤温度、血流量，改善局部微循环，促进组织细胞能量代谢，[10-13]并能使皮下毛细血管扩张和破裂，局部组织发生炎症反应，使组织中的TNF-α、IL-6、IL-12、IL-23等炎症因子上调，DCs(树突状细胞，dendritic cells)、T淋巴细胞、F4/80巨噬细胞等免疫激活细胞比率升高，细胞因子水平发生变化，对血液中的胆红素、超氧化物歧化酶、细胞因子、血细胞及神经递质等也有影响，刮痧后皮下组织和血液中相关化学物质的变化是刮痧提高肌体免疫力，起到保健、治疗作用的主要机理。[14-16]

经穴处的肥大细胞较非经穴处数目更集中，功能更为活跃，针刺可激活局部肥大细胞，释放神经递质、细胞因子、激素等多种信号分子，这些信号分子又可兴奋周围神经末梢感受器，释放大量化学物质，物质间相互作用，启动针刺效应。[17-18]本实验中刮痧前与刮痧后不同时间节点的肥大细胞数比较、肥大细胞脱颗粒率比较差异均无显著性(P>0.05)，可见刮痧后90 min内肥大细胞的功能状态没有发生明显改变。推测可能与刺激方式不同有关，刮痧主要以对皮肤的按压力和摩擦力为主，对皮肤下结缔组织的影响相对较小，而针刺作为一种机械刺激，针体刺入皮下组织并进行提插捻转时，针体可深入到穴位处的结缔组织中，可导致穴区结缔组织中的胶原纤维变形，细胞骨架重排，[19]有研究表明穴位处胶原纤维结构的破坏可明显减弱肥大细胞脱颗粒程度及手针介导的镇痛效应。[20]刮痧对皮肤的刺激是否可导致穴位处胶原纤维变形尚未可知，推测刮痧后肥大细胞功能状态并未激活与刮痧刺激对穴位处胶原纤维的影响程度有关。另有研究结果显示，皮下肥大细胞膜上存在具有机械敏感性的TRPV2通道，针刺的机械力传递给皮下的肥大细胞时，需要达到一定阈值，该通道才能被激活，进而引起胞内Ca2+浓度增加，引发活性物质的分泌释放，从而作用于周围的神经末梢上行传导针刺信号。[21]本实验中刮痧前后肥大细胞功能状态并未发生明显改变也可能与刮痧产生的机械力并没有达到一定的阈值，肥大细胞膜上的TRPV2通道没有被激活有关。

肥大细胞活化后能释放多种活性物质，其中类胰蛋白酶是肥大细胞活化和释放颗粒的特异性标志。[22]本实验中，类胰蛋白酶免疫组织化学染色与肥大细胞甲苯胺蓝特殊染色所得到的结果一致，刮痧前与刮痧后不同时间节点的类胰蛋白酶阳性细胞数比较差异均无显著性(P>0.05)，但类胰蛋白酶标记的细胞数却少于甲苯胺蓝特殊染色所得到的肥大细胞数，推测与肥大细胞脱颗粒状态有关。

本实验研究结果显示刮痧后以及刮痧后的90 min内肥大细胞的功能状态并未发生改变，但现有研究结果显示刮痧后皮下组织增多物质与肥大细胞激活后释放的化学物质有许多相似之处，如TNF-α、IL-6等，[15，18]推测刮痧后皮下增多的这些化学物质可能是非肥大细胞源性，刮痧后短时间内可能并没有通过激活肥大细胞而发挥治疗和保健效应。

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(2017-04-20 收稿)

Effect ofGuashaon the Functional Status of Partial Mast Cells in Normal RatsHebei University of Chinese Medicine

PANLi-jiaZHANGJun-chaFANXi-shengZHANGXiao-qiLIUJunXINGHai-jiaoZHANGXuan-pingYANGYan-weiSHEYan-fen

(Shijiazhuang 050200)

Objective: to observe the functional status of partial mast cells before and after scraping so as to reveal the functional mechanism ofGuashatherapy. Methods: The normal Wistar rats were randomly divided into pre-scraping group, instant group after scraping, 30 min group, 60 min group, and 90 min group, 10 rats each group. Except pre-scraping group, all the others were intervened withGuasha, scraping Du meridian and Bladder meridians, 60 times /min, for 30 seconds each time. The rats of each group were killed off before scraping, and instantly, 30 min, 60min and 90 min after scraping respectively, materials taken from the most obvious part of one Bladder meridian. Toluidine blue staining and Immunohistochemical tests were used to observe the number of mast cells, degranulations and tryptase expression. Results: there was no significant difference between the numbers of mast cells,P>0.05; degranulation rates of each group had no significant difference,P>0.05; there was no significant difference between numbers of positive tryptase,P>0.05. Conclusion: the functional status of mast cells has no obvious changes instantly after scraping and 90 min after scraping, that is,Guashadoes not affect the partial mast cells in normal rats instantly after scraping. It therefore can be predicted that the instant effect ofGuashatherapy is irrelative to mast cells.

mast cells;Guasha; tryptase; rats; experimental study

*河北省科技厅资助项目：No.132777236；河北省中医药管理局资助项目：No.2015083；河北中医学院青年基金项目：No.QNZ2016016

佘延芬，女，博士，教授，硕士研究生导师。

R244.4

A

1007-5615(2017)04-0046-04

针灸推拿学研究