溃结爽灌肠组方不同组分对实验性溃疡性结肠炎大鼠的治疗中单因素效应及量效关系分析*

河北省石家庄市中医院

郑彩华 郭爱林△ 李 晶△ 郭光业 常玉娟 冯秀贤 张 娜(石家庄 050051)

溃结爽灌肠组方不同组分对实验性溃疡性结肠炎大鼠的治疗中单因素效应及量效关系分析*

河北省石家庄市中医院

郑彩华 郭爱林△李 晶△郭光业 常玉娟 冯秀贤 张 娜(石家庄 050051)

目的：通过正交试验设计，对溃结爽组方中苦参、地榆、黄柏、白及4味中药的单因素效应进行分析，观察其对溃疡性结肠炎(UC)大鼠的治疗作用，并探讨他们之间的量效关系及其最佳配伍，为临床中药灌肠组方提供依据。方法：清洁级雄性wistar大鼠70只，应用正交试验设计，组方各因素取三水平， 选用L9(34)正交表，进行9组试验。以葡聚糖硫酸钠(DSS)灌胃造模成功后灌肠治疗10 d，评估各组大鼠基础状况并计算疾病活动指数(DAI) ; 苏木精-伊红(HE) 染色后显微镜下观察其病理变化并评分；ELISA法检测大鼠结肠黏膜白细胞介素10(IL-10)，白细胞介素17(IL-17)表达水平。结果：组方中苦参、地榆、黄柏、白及4味中药在三水平均可降低大鼠结肠黏膜促炎因子IL-17表达水平，提高抑炎因子IL-10表达；苦参、白及可明显提高IL-10表达，降低IL-17含量，并且在1水平效应最高，但随用量增加效应降低；地榆在2水平时，可明显提高IL-10表达，在3水平时，可明显降低IL-17含量；黄柏在2水平时，可明显提高IL-10表达，在1水平时，可明显降低IL-17含量；A、B、C、E、F、G、I组的IL-17含量均显著低于模型组，IL-10表达显著高于模型组，差异具有显著性(P<0.05)，D、H组IL-17含量低于模型组，IL-10表达高于模型组，但差异无显著性(P>0.05)。溃结爽灌肠组中(A、B、C、E、F、G、I组)大鼠疾病活动指数(DAI)、结肠病理评分较模型组均有不同程度改善，结果与炎症因子IL-17、IL-10表达水平变化一致。结论：溃结爽灌肠组方可以显著改善UC大鼠症状、结肠组织学评分，其治疗作用可能与降低大鼠结肠黏膜促炎因子IL-17表达、提高抑炎因子IL-10水平有关，从而维持肠道稳态，促进肠道黏膜修复。

溃疡性结肠炎;肠澼;久痢;休息痢;溃结爽;中药灌肠;IL-10;IL-17;中药组方

溃疡性结肠炎(UC) 以迁延不愈、反复发作、病因复杂为特征，其发病可能涉及多因素、多环节综合作用，临床表现以腹痛、腹泻、黏液脓血便等直、结肠非特异性炎症病变为主，不同患者间因病变部位、病变程度不同，表现不尽相同，重症患者可同时伴有肠外多器官损害。[1]目前研究表明，细胞因子网络失衡在UC肠道黏膜免疫反应的过程中具有重要作用。[2]我国的溃疡性结肠炎患者多为轻度及中度，病变部位多在乙状结肠和直肠(脾曲以远)，因此临床上灌肠等局部用药对于该病的治疗具有重要意义。[3-4]中药灌肠治疗作用直接、疗效显著，目前在国内广泛应用。溃结爽方灌肠在临床应用中每获显效。本研究通过正交试验设计，观察溃结爽方灌肠对UC模型大鼠疾病活动指数(DAI)、结肠病理评分、大鼠结肠黏膜白细胞介素10(IL-10)，白细胞介素17(IL-17)水平，探讨其对UC大鼠炎症水平的影响及疗效机制，苦参、地榆、黄柏、白及4味中药的之间的量效关系及其最佳配伍，为临床中药灌肠组方提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：清洁级雄性wistar大鼠70只，7 ～ 8 周龄，体质量( 200±20) g，由河北医科大学实验动物中心提供。动物合格证号: SCXK(冀) 2013-1-003，实验动物合格证号:1610114。大鼠正常饮食，自由饮水，在室温22℃下饲养，相对湿度40%～60%，正常光照。

1.1.2 药物制备：溃结爽方(药物组成：苦参，地榆，黄柏，白及)购于石家庄市中医院中药房，根据实验方案用蒸馏水配制成不同浓度的混悬液，置于 4 ℃冰箱备用；葡聚糖硫酸钠(DSS)，Sigma公司中国代理。

1.1.3 试剂与仪器：倒置显微镜：Olympus公司；酶标仪( BS-1101) ，南京德铁实验设备有限公司。大鼠IL-10Elisa试剂盒:上海恪敏生物科技有限公司(货号：KB2735)；大鼠IL-17Elisa试剂盒：上海恪敏生物科技有限公司(货号：KB2628)。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模：基础喂养适应性喂养1周后，随机取6只为正常组(K组)，饮用蒸馏水。其余64只为模型复制组。用蒸馏水将DSS[4]溶解成浓度为5%的溶液，灌胃并自由饮用7 d，每日1次，每次4 mL，灌胃后常规饲养。造模第7 d结束后从模型组随机抽取4只处死，用以判断模型复制情况，制作结肠病理切片观察UC实验模型大鼠是否建立。将造模成功的60只大鼠随机分为10组，分别是从第A组到第I组、模型对照组(J组)，每组6只。

1.2.2 给药方法

1.2.2.1 大鼠给药剂量：按临床成人(人的体质量按70 kg算)用量的6.3倍，1次/d，每次2 mL，连续10 d。模型组及正常组给予相同计量0.9%氯化钠溶液灌肠。治疗组具体灌肠用药如下：A组3.69 g/kg，B组6.48 g/kg，C组9.27 g/kg，D组6.93 g/kg，E组7.02 g/kg，F组8.19 g/kg，G组7.47 g/kg，H组8.64 g/kg，I组8.73 g/kg。

1.2.2.2 灌肠方法：用儿童肛软管轻轻从大鼠肛门插入深度为8 cm， 每只大鼠灌肠2 mL，将各组药液缓慢注入肠道，灌肠后大鼠倒挂安置10 min以延长灌肠液在肠道内的停留时间，从而达到保留灌肠的目的，之后自由饮食。疗程；连续 10 d，1 次/d。疗程结束后禁食不禁水1 d，之后处死动物取材备用。

1.2.2.3 具体用药分组： 药物，a=苦参， b=地榆，c=黄柏，d=白及。各因素取3水平，L1、L2、L3。a：苦参，L1=10 g，L2=20 g，L3=30 g；b：地榆，L1=15 g，L2=30 g，L3=45 g；c：黄柏，L1=6 g，L2=12 g，L3=18 g；d：白及，L1=10 g，L2=20 g，L3=30 g。不考虑各因子之间的的交互作用。

表头设计：采用L9(34)正交表。

列号abcd因子1234

各试验组方：

A.苦参10 g，地榆15 g，黄柏6 g，白及10 g。

B.苦参10 g，地榆30 g，黄柏12 g，白及20 g。

C.苦参10 g，地榆45 g，黄柏18 g，白及30 g。

D.苦参20 g，地榆15 g，黄柏12 g，白及30 g。

E.苦参20 g，地榆30 g，黄柏18 g，白及10 g。

F.苦参20 g，地榆45 g，黄柏6 g，白及20 g。

G.苦参30 g，地榆15 g，黄柏18 g，白及20 g。

H.苦参30 g，地榆30 g，黄柏6 g，白及30 g。

I.苦参30 g，地榆45 g，黄柏12 g，白及10 g。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 疾病活动指数：分别在造模结束后(第8 d)以及治疗结束后(第18 d)对各组大鼠进行DAI评分。DAI评分=(大鼠大便性状得分+大鼠体质量下降得分+大鼠便血得分)/3，具体标准见表1。

表1

DAI评分表

1.3.2 酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定肠黏膜IL-10、IL-17水平： 采用ELISA 法检测UC大鼠肠组织 IL-10、IL-17含量。灌肠给药10 d后，各组大鼠禁食水24 h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取肛门以上2 ～ 10 cm 结肠组织，生理盐水冲洗后，滤纸吸干水分，分装于冻存管中，冷冻于液氮罐中备检。检测时取出肠组织，各加5 倍的生理盐水，超声粉碎机匀浆，4 ℃，3 500 r / min 离心20 min，取上清，存放于1.5 mL EP管中。ELISA 法检测UC 大鼠肠组织IL-10、IL-17含量的变化，检测方法同说明书。采集实验数据，计算样本含量。

1.3.3 HE 染色观测病理组织学情况并评分：取肛门以上2 ～ 10 cm 结肠组织，生理盐水冲洗干净，多聚甲醛固定，梯度脱水，石蜡包埋，常规 HE染色，光镜观察，并由经验丰富的病理教师对其进行量化双盲评分。[4]光镜下HE染色评分分数是由上皮细胞与炎细胞浸润情况共同决定的，是2项分数之和。具体评分标准见表2。

表2

UC大鼠结肠病理组织学评分

2 结果

2.1 大鼠DAI评分 在实验进程中正常组6只大鼠状态良好，进食进水量正常，被毛紧密色白有光泽，粪便呈颗粒状，无腹泻，无血便，体质量逐渐增加。造模开始后，除正常组外，其他各组大鼠均有不同程度精神萎靡、肉眼血便、体质量下降，被毛稀松毛色泛黄无光，肛周污染严重。造模结束后，各模型组大鼠DAI评分显著高于空白组，差异具有显著性(P<0.05)。溃结爽灌肠治疗开始后，A、B、C、I组大鼠出现不同程度好转。治疗第10 d，A、B、C、I组大鼠活动增加，饮食量及体质量增加，大便未见到黏液脓血，一般状态明显优于模型组大鼠。E、F、G组大鼠精神亦有所好转，但形态较为消瘦，进食进水量较少，粪便接近成形，但仍偶可见肉眼血便，有轻微肛周污染。D、H组虽有所改善，但大鼠精神仍较差，体型瘦削，被毛无光泽，活动较少，大便稀溏，偶见黏液脓血，肛周不同程度污染。A、B、C、I、E、F、G组大鼠DAI评分较模型组明显改善，差异具有显著性(P<0.05)。D、H组虽有所改善，但差异无显著性(P>0.05)。详见表3。

表3

大鼠DAI评分

2.2 溃结爽方灌肠对UC 大鼠结肠组织中IL-17、IL-10水平的影响 大鼠造模成功后, 连续灌肠10 d，结肠组织中IL-10、IL-17水平结果如表4所示。UC 模型组结肠组织中IL-17水平均显著高于正常组，IL-10显著低于正常组，差异具有显著性(P<0.05)。溃结爽灌肠方组结肠组织中A、B、C、E、F、G、I组的IL-17含量均显著低于模型组，IL-10水平显著高于模型组，差异具有显著性(P<0.05)。D、H组IL-17含量低于模型组，IL-10水平高于模型组，但差异无显著性。溃结爽各剂量组呈现一定的量效关系，组方中苦参、地榆、黄柏、白及4味中药在三水平均可降低大鼠结肠黏膜IL-17水平，提高IL-10含量。苦参、白及可明显提高IL-10表达，降低IL-17含量，并且在1水平效应最高，但随用量增加效应降低。地榆在2水平时，可明显提高IL-10表达；在3水平时，可明显降低IL-17含量。黄柏在2水平时，可明显提高IL-10表达；在1水平时，可明显降低IL-17含量。详见表5。

表4 溃结爽灌肠对UC大鼠结肠黏膜IL-10、IL-17水平的影响

注: 与模型组比较，△P< 0.05；与正常组比较，*P< 0.05

2.3 病理组织学情况 正常组(K组)大鼠结肠黏膜结构正常，腺体排列规整，杯状细胞正常存在无减少；模型组(J组)大鼠结肠黏膜层可见大量浸润的炎性细胞，隐窝结构消失，腺体破坏，杯状细胞基本消失，部分黏膜上皮脱落，形态、结构被破坏；各治疗组在溃结爽灌肠治疗后与J组相比均有不同程度的改善，以炎症表现为主，A、B、C、I 组大鼠在结肠黏膜可见少量炎性细胞浸润，腺体排列较为整齐；E、F、G组大鼠炎性细胞浸润到结肠黏膜下层甚至固有层，杯状细胞减少；D、H组大鼠结肠腺体紊乱，可见分支现象，偶见肉芽组织增生。

溃结爽灌肠治疗后，溃疡性结肠炎模型组大鼠(J组)结肠病理组织学评分显著高于正常组，差异具有显著性(P<0.05)；溃结爽灌肠方A、B、C、E、F、G、I组的病理组织学评分均显著低于模型组，差异具有显著性(P<0.05)；D、H组结肠病理组织学评分低于模型组，但差异无显著性(P>0.05)。详见表6。

表6 UC大鼠结肠病理组织学评分

3 讨论

UC属于中医学“休息痢”“久痢”“大瘕泄”“肠澼”等范畴。[5]《素问·太阳阳明篇》云：“饮食不节，起居不时者，阴受之，阳受之则入六腑，阴受之则入五脏……入五脏则满闭，下则飧泻，久为肠澼。”该病发病机制尚未完全明确，细胞因子网络失衡在UC肠道黏膜免疫反应的过程中具有重要作用。目前研究表明，肠道黏膜炎症的发生发展，与肌体中促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间的平衡状态被打破有关。相关研究发现，炎性反应具有促进UC 发生发展的作用，UC 患者 IL -17 、肿瘤坏死因子-α( TNF-α) 等促炎因子水平明显升高，IL-10 等抗炎因子水平明显降低，促炎因子/抑炎因子失衡是导致肠道炎性反应重要原因之一。[6]

IL-17是由Th 17细胞分泌的一种强促炎因子，能够激活并募集大量炎性细胞到肌体相应部位引发炎症反应，参与了多种自身免疫性疾病的发生发展，[7]并且IL-17的表达水平与溃疡性结肠炎的炎性反应程度及疾病进展密切相关，有研究发现，[8]病情越严重的UC患者肠组织中IL-17 的表达水平越高，呈正相关。与IL-17生物学作用相反，IL-10能够抑制致炎细胞因子的释放从而抑制炎症反应，是典型的抗炎与免疫抑制性细胞因子。IL-10的免疫调节活性基于其抑制细胞因子合成和抗原递呈的能力。[9]研究显示，活动期的UC患者 IL-10 的结肠组织含量明显降低，缓解期有所上调，并且与病变范围和病情严重程度呈负相关，所以 IL -10 在 UC 中可能是保护性因素。即使在正常饲养条件下(无特异性致病菌感染)IL -10的缺失能够自发诱导多种自身免疫疾病的发生，如类似于克罗恩病的结肠炎，[10]慢性非感染性肠道炎症[11]等。由此印证了IL-10 等炎症因子在维持正常肠道黏膜免疫调节和炎症反应平衡中发挥了重要作用。[12]

根据疾病严重程度，我国的UC患者多为轻度及中度，病变部位多在乙状结肠和直肠(脾曲以远)，所以临床上灌肠等局部用药对于该病的治疗具有重要意义，[4]并在指南中得到肯定。中药灌肠可使药物与病变部位直接接触，药物直达病所，使之充分接触病灶，有效成分直接通过肠道黏膜吸收，提高了病变部位的血药浓度，使药物迅速被吸收，改善组织营养和血供，修复肠道溃疡面，促进溃疡愈合，充分发挥药物的局部治疗作用；同时由于避免了肝脏的首过消除效应，减少了药物在肝脏及胃肠多种酶对药物的破坏，生物利用度得到了充分发挥，且无明显毒副作用，是临床常用的重要治疗方法之一。因此，寻找更加有效的中药灌肠方具有重要的临床意义。

笔者曾对146首中药治疗UC灌肠方药物进行统计，根据每味药物的应用频数，依次为：苦参、地榆、黄柏、白及、三七、大黄、五倍子、明矾、马齿苋、黄连、槐花、儿茶等。此次统计与溃结爽组方相一致。溃结爽灌肠方(黄柏，苦参，地榆，白及)以清热燥湿、凉血解毒、止血生肌为组方原则，在其长期临床应用中，疗效明显。黄柏苦寒，入肾、膀胱、大肠经，清热燥湿，泻火解毒，现代药理研究其具有抗菌抑菌，改善创面微循环，促进溃疡愈合的作用。苦参苦寒,入大肠、小肠、胃、肝、心经，主治热毒血痢,肠风下血, 赤白带下等，叶天士称其“治痢极效, 百发百中之药”，其同样可以抗菌杀虫，抗病毒，抗炎，调节免疫。地榆苦酸涩，微寒，归大肠、肝经,功能清热解毒、凉血止血，《药性论》谓：“止血痢蚀脓。”抑菌抗炎的同时还可止泻止血。白及苦甘涩、微寒,入肺经，功擅止血、消肿,生肌、敛疮, 其可止血，促进溃疡愈合。

临床有1 d灌肠2次，甚至1次灌2付药，亦取得非常满意的疗效。启发笔者可以针对患者病情，灵活调整药量来提高药效。中医不传之秘在用量，所以采用正交试验设计处理这种多因素多水平实验，通过综合比较和方差分析，对苦参、地榆、黄柏、白及4味中药的单因素效应进行分析，在探寻其疗效机制的同时，并确定他们之间的量效关系及其最佳配伍，为临床中药灌肠组方提供依据。

本研究结果显示，模型组大鼠结肠黏膜组织中IL-17水平显著高于正常组(P<0.05)，IL-10表达量明显低于正常组(P<0.05)；溃结爽灌肠组A、B、C、E、F、G、I组大鼠结肠组织中IL-17水平较模型组明显降低(P<0.05), IL-10表达量均明显高于模型组(P<0.05),差异具有显著性。研究初步证实溃结爽灌肠可降低UC结肠组织中促炎因子IL-17的水平，提高抑炎因子IL-10含量，减轻肌体免疫反应，改善肌体炎症反应状态。造模后，大鼠出现不同程度精神倦怠，体质量下降，饮食量减少，大便稀溏，甚至排黏液脓血，肛周污染；各剂量组溃结爽灌肠过程中大鼠外观体征均有不同程度好转。A、B、C、I组大鼠改善明显，精神好转，体质量、进食进水量增加，皮毛、排便情况等较前改善。病理组织学观察结果显示，模型组大鼠结肠黏膜炎性细胞浸润，杯状细胞减少或消失，腺体破坏，被浸润的炎症细胞替代，个别黏膜层明显变薄，个别肌层组织炎症较重，失去正常结构的程度，溃结爽不同剂量组大鼠的病变都较前减轻，其中以A、B、C、I组大鼠改善明显。此外，IL-17 、IL-10与UC大鼠DAI评分、病理组织学评分有明显的相关性，结果一致。说明溃结爽灌肠对 UC 模型大鼠具有较显著的治疗作用。

本研究结果显示，溃结爽灌肠后大鼠结肠黏膜促炎因子IL-17的含量明显降低，而抑炎因子IL-10的水平上调，并且DAI评分及结肠组织病理学表现较模型组也有所改善，说明溃结爽能调节UC大鼠抗炎和抑炎因子的失衡，使其恢复平衡，抑制或缓解结肠黏膜炎症反应，从而使受损肠道黏膜得到修复和一定程度的愈合。另外，实验结果同时提示，结肠组织炎症因子表达的失衡情况与结肠的损伤程度具有一致性，这从另一角度印证了溃结爽治疗 UC 的机制可能与其对炎症因子的调控作用有关。维持或调节促炎因子与抗炎因子之间的平衡，恢复 UC 大鼠免疫功能，这可能是溃结爽治疗 UC 免疫机制之一，也可能成为今后 UC 治疗的新策略和新方法。但中药复方作用机制复杂，其相关机理还有待进一步的研究。

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(2017-06-04 收稿)

*河北省中医药管理局科学技术研究计划项目：No.2016102

R285.5

A

1007-5615(2017)04-0037-05

方 药 研 究