希望III号液改善臭氧加重二乙基亚硝胺致肝损伤的药效作用研究*

北京中医药大学基础医学院

刘琳琳 张 睿 彭金娥 赵 欣△ 蔡大勇△ 王玥琦(北京 100029)

希望III号液改善臭氧加重二乙基亚硝胺致肝损伤的药效作用研究*

北京中医药大学基础医学院

刘琳琳 张 睿 彭金娥 赵 欣△蔡大勇△王玥琦(北京 100029)

目的：探讨希望III号液对臭氧加重二乙基亚硝胺(DEN)致大鼠肝损伤的治疗作用。方法：48只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、维生素E组、希望III号液低、中、高剂量组，每组8只。对照组吸入新鲜空气，腹腔注射(ip)生理盐水50 mg/kg；各造模组腹腔注射DEN 50 mg/kg，每周2次，同时吸入臭氧(0.65±0.12) ppm, 4 h/d，各组于造模2周后开始给药，其中对照组和模型组每天灌胃(ig)饮用水，各给药组同步灌胃维生素E(13.5 mg/kg)与希望III号液(45、90、180 mg/kg)治疗。给药8周后取大鼠血清和肝脏组织，检测大鼠血清转氨酶(ALT和AST)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、碱性磷酸酶(ALP)和丙二醛(MDA)、分型超氧化物歧化酶(CuZn-SOD、T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量；肝脏组织常规HE染色、Masson染色观察组织形态；形态剂量肝细胞体积构成比、肝胶原纤维体积比。结果： 模型组大鼠血清ALT、AST、GST、ALP、MDA含量升高(P<0.01)， CuZn-SOD、T-SOD和GSH-Px含量降低(P<0.01)，肝细胞体积构成比增大(P<0.01)，胶原纤维沉积增加(P<0.01)。希望III号液能抑制大鼠血清ALT、AST、GST、ALP、MDA含量升高(P<0.01)，回升CuZn-SOD、T-SOD和GSH-Px含量(P<0.01)，回降肝细胞体积构成比和胶原纤维沉积增加(P<0.01)。 结论：希望III号液可以改善肝损伤状态下肝脏功能，调节肌体氧化应激过程，延缓肝脏纤维化进程，对臭氧加重DEN致大鼠肝损伤有保护作用。

肝损伤；希望III号液；臭氧；二乙基亚硝胺；滋阴理气

《素问·六节藏象论》 曰：“ 天食人以五气, 地食人以五味”，论及了环境与人之间的密切关系，指出天地对人的关爱,通过五气和五味体现出来。[1]作为亚硝胺类化合物的前体物质，亚硝酸盐在自然界中广泛存在，食物在加工过程中易转化成亚硝胺和其他N-亚硝基化合物，危害人体健康。[2]亚硝胺类化合物对肝脏损伤的研究已较为成熟，然而，人生活在自然环境中，受多元因素的影响，当前，我国近地表臭氧浓度受工业化进程的影响逐年攀升，大气臭氧污染日益严重，在人口密集的城市群地区情况尤为严重。[3]研究旨在探讨希望III号液对臭氧加重二乙基亚硝胺(DEN)致大鼠肝损伤的治疗作用。希望III号液主要由枸杞子和佛手组成，枸杞子补肾益精、养肝明目、补血安神，佛手理气化痰、舒肝健胃，二者合用，具有滋阴理气的功效。[4-6]

1 材料

1.1 动物 Wistar大鼠〔北京维通利华实验动物技术有限公司， SCXK(京)2012-0001〕，雄性，48只，SPF级，体质量180～200 g。

1.2 药品和试剂 希望III号液(主要由枸杞子和佛手组成， 生药饮片均购自北京同仁堂药店，由北京中医药大学中医药基础理论与关键技术中心配制)；维生素E软胶囊，每粒100 mg，(天津市中央药业有限公司，批号：160410)。生化试剂盒ALT、AST、GST、ALP、MDA、CuZn-SOD、T-SOD、GSH-Px购自南京建成生物工程研究所(批号：20160704)。

1.3 仪器 臭氧发生器(山东精工好医生仪器有限公司)；酶标仪(Multiskan MK3，热电上海仪器有限公司)；电子恒温水浴箱(北京长风仪器仪表公司)；高速台式离心机(GT16-3型，北京时代北利离心机有限公司)；旋涡混合器(QL-901，海门市麒麟医用仪器厂)；石蜡包埋机(SleeMPS/P2型，德国SLEE)；石蜡切片机(RM2245，德国Leica)。

2 方法

2.1 动物分组、造模及取材 适应性喂养1周后，将大鼠按体质量随机分为对照组、模型组、维生素E组、希望III号液低、中、高剂量组，每组8只。对照组吸入新鲜空气，腹腔注射(ip)生理盐水50 mg/kg；各造模组腹腔注射DEN 50 mg/kg，每周2次，同时吸入臭氧(0.65±0.12)ppm, 4 h/d，染毒柜与臭氧发生器连接，参照国家标准(靛蓝二磺酸钠分光光度法)实时监测染毒柜内的臭氧浓度，2周后结束造模，开始给药，其中对照组和模型组每天灌胃(ig)饮用水，各给药组同步灌胃维生素E(13.5 mg/kg)与希望III号液(45、90、180 mg/kg)治疗。给药8周后取材，腹主动脉取血，分离取血清；取肝脏组织于中性福尔马林中固定48 h。

2.2 指标检测

2.2.1 血清生化指标检测：腹主动脉取血，分离血清，按试剂盒说明书检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、碱性磷酸酶(ALP)、丙二醛(MDA)、分型超氧化物歧化酶(CuZn-SOD、T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平。

2.2.2 组织病理学形态观察：取肝脏组织于中性福尔马林中固定48 h，换PBS，将肝脏组织修成1 cm×1 cm的方块，梯度酒精脱水、二甲苯固定、浸蜡之后，将组织包埋成蜡块，切片机3～4 μm切片，HE染色、Masson染色进行组织形态学观察，对比分析各组大鼠肝脏组织病理变化。

2.2.3 形态计量：将病理切片在40×10倍数下进行扫描，保存病理图片。肝细胞体积构成比、肝胶原纤维体积比使用Image-Pro Plus软件进行分析。

2.3 统计学分析 使用SPSS22软件进行统计分析，各组数据以均值±标准差表示，对数据进行正态性和方差齐性检验，多组数据采用单因素方差分析，2组数据采用t检验，P<0.05为差异有显著性。

3 结果

3.1 希望III号液改善大鼠肝脏功能 与对照组相比，模型组大鼠血清ALT、AST、GST、ALP含量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，维生素E组和希望III号液低、中、高剂量组ALT、AST、GST、ALP含量显著降低(P<0.01)。结果详见表1。

组别剂量(mg/kg)ALT AST GSTALP对照组/538±060740±06928491±18201773±187模型组/1452±149∗∗1249±098∗∗47866±3301∗∗4253±314∗∗维生素E组135720±081##935±038##35391±2540##2882±234##低剂量组450735±075##872±056##31718±2338##2610±232##中剂量组900656±053##821±068##30309±1952##2396±190##高剂量组1800648±054##844±056##31003±2351##2291±225##

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01

3.2 希望III号液改善大鼠氧化应激功能 与对照组相比，模型组大鼠血清MDA含量升高(P<0.01)，CuZn-SOD、T-SOD和GSH-Px含量降低(P<0.01)；与模型组相比，维生素E组和希望III号液低、中、高剂量组MDA含量降低(P<0.01)，CuZn-SOD、T-SOD和GSH-Px含量回升(P<0.01)。结果详见表2。

3.3 希望III号液改善大鼠组织形态

组别剂量(mg/kg)MDA(nmol/mgprot)CuZn-SOD(U/mgprot)T-SOD(U/mgprot)GSH-Px(活力单位)对照组/968±09217185±116923361±152048318±3107模型组/2242±169∗∗11441±908∗∗17870±1586∗∗35896±2312∗∗维生素E组1351510±097##13388±1028##21081±1642##41091±3264##低剂量组4501327±145##14552±953##21162±1333##43269±3237##中剂量组9001429±142##14932±1264##21337±1472##44309±3728##高剂量组18001375±104##15194±1276##21657±1659##43971±2971##

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01

3.3.1 肝细胞体积比变化情况：对照组大鼠肝细胞大小适中，胞核染色均匀，核膜完整。模型组肝细胞数量减少，肝细胞代偿性肥大，可见纤维增生，汇管区有出血点，淋巴细胞显著聚集；胆管增生，肝索排列紊乱，可见出血灶；核固缩，双核细胞增多，胞浆出现脂肪样变性。结果见图 1。形态计量结果显示，与对照组比较，模型组肝细胞体积比升高(P<0.01)；与模型组相比，维生素E组和希望III号液低、中、高剂量组肝细胞体积比回降(P<0.01)。结果详见表3。

3.3.2 胶原纤维沉积变化情况：对照组大鼠胶原纤维含量较少，在汇管区和中央静脉周围，分布规则。模型组胶原纤维含量增加，由汇管区向肝小叶延伸。结果见图 2。形态计量结果显示，与对照组比较，模型组胶原纤维体积比升高(P<0.01)；与模型组相比，维生素E组和希望III号液低、中、高剂量组胶原纤维胞体积比回降(P<0.01)。结果详见表3。

图1 各组肝细胞体积比情况(HE，×400)

图2 各组肝脏胶原纤维沉积情况(Masson，×400)

表3

希望III号液改善肝细胞体积比和胶原纤维体积比 ±s,n=8)

注：与对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01

4 讨论

《素问· 六节脏象论》说:“五气入鼻, 藏于心肺，上使五色修明，音声能彰；五味入口, 藏于肠胃, 味有所藏, 以养五气，气和而生，津液相成，神乃自生。”而天地对人的关爱不是无条件的，而是以顺应四时为规则的，当平衡被打破，浊毒伤人，肌体气血阴阳失调，则变生各种疾患。[1]

亚硝胺是世界公认的三大致癌物质之一,可使多种动物的多种器官组织产生肿瘤，1次大剂量或多次少量长期摄入均可致癌。[7]亚硝酸盐是亚硝胺类化合物的前体物质，广泛存在于自然界环境中。根据目前已有的结果，鱼类、肉类、蔬菜类和啤酒类等食品中含有较多的亚硝胺类化合物，[8]在烟草、化妆品、饮用水消毒副产物、橡胶制品中也含有较多的亚硝胺类物质，[9-13]这些物质可经呼吸道、皮肤、消化道等多种途径直接摄入人体。关于DEN造成肝脏损伤笔者已经有较为明确的认识，[17]而近年来，地球对流层大气平均臭氧浓度逐年增加，工业革命前对流层大气平均浓度为38 ppb，[14]2000年已经上升到50 ppb，预计到2050年，近地表的平均浓度将增加至70 ppb,明显高于伤害临界值。[15]随着工业化进程的加快，我国近地表臭氧浓度也明显增加，其中长江三角洲地区臭氧浓度最大值接近160 ppb。[3]针对日益增加的臭氧浓度污染，越来越多的科学家和公众开始密切关注臭氧危害，科学家们从事了大量的科学研究。[16]本实验旨在探究臭氧对DEN造成的肝脏损伤的加重作用及希望III号液对肝脏的保护作用。

自由基能氧化细胞膜上脂质成分、组织或酶中的蛋白质以及糖类，导致过氧化损伤。给予DEN后，动物体内活性氧产生，引发氧化应激压力，同时也导致抗氧化剂的消耗，加强了对细胞的损伤；臭氧作为外源性刺激物，可刺激肌体产生自由基，加强DEN造成的肌体过氧化损伤。枸杞子味甘，性平，入肝、肾二经。现代研究表明，枸杞子中含多种营养成分和微量元素，其中主要有效成分枸杞子多糖在肌体免疫、降血糖、降血脂、抗衰老、抗疫劳、抗肿瘤、保肝及生殖系统保护等方面有药理作用。[4-5]佛手性味辛、苦、温，入肝、脾、胃、肺经。《本草便读》言其“理气快膈，惟肝脾气滞者宜之”。[6，18]现代研究表明佛手具有止咳平喘祛痰、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抑菌、抗炎等作用。

生化指标AST、ALT、ALP、GST ,可以反映肝细胞受损的严重程度。[19-20]在肝细胞受到损害后，细胞变性、坏死，细胞膜破碎或细胞膜的通透性增加，肝细胞中所含的 ALT 和 AST 就会被释放到血液中，使血中 ALT、AST 活性增加。[21-22]GST与肝脏解毒有关,当肝细胞受损害时,常很早释放到血中,血中GST的升高常常早于ALT和AST,因而GST的升高可作为肝脏损伤的敏感指标。[23]研究表明，氧化应激不仅是臭氧损伤的重要机制之一，同时也是导致亚硝胺损伤的重要机制。[24]肌体主要抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，参与清除活性氧自由基，抗氧化储备。[25]丙二醛(MDA)是膜脂质过氧化反应的最终分解产物,对细胞内膜系统，蛋白质以及核酸造成直接损伤，反映细胞的脂质过氧化程度。[26]

实验采用DEN和臭氧制备肝损伤模型，结果显示模型组大鼠血清ALT、AST、GST、ALP、MDA含量升高(P<0.01)， CuZn-SOD、T-SOD和GSH-Px含量降低(P<0.01)，肝细胞体积构成比增大(P<0.01)，胶原纤维沉积增加(P<0.01)。希望III号液能抑制大鼠血清ALT、AST、GST、ALP、MDA含量升高(P<0.01)，回升CuZn-SOD、T-SOD和GSH-Px含量(P<0.01)，回降肝细胞体积构成比和胶原纤维沉积增加(P<0.01)。证实希望III号液可以改善肝损伤状态下肝脏功能，调节肌体氧化应激过程，延缓肝脏纤维化进程，对臭氧加重DEN导致大鼠肝损伤具有保护作用。

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(2017-07-10 收稿)

*北京中医药大学创新团队基金资助项目：No.2011-CXD-04

王玥琦，女，博士研究生导师，教授。

R285.5

A

1007-5615(2017)04-0042-05

△中国医学科学院药用植物研究所(北京100193)