去泛素化酶Usp46基因在系统性红斑狼疮患者血液中的表达及意义

张 玮，魏 群，郭惠芳，郑桂敏，张莲之，彭媛媛，刘淑霞

(1.河北医科大学 病理教研室，河北 石家庄 050017；2.河北省人民医院医院 a.感染管理科；b.免疫风湿科，河北 石家庄 050051；3.河北医科大学第二医院 免疫风湿科，河北 石家庄 050000)

·论著·

去泛素化酶Usp46基因在系统性红斑狼疮患者血液中的表达及意义

张 玮1，魏 群2a，郭惠芳3，郑桂敏2b，张莲之1，彭媛媛1，刘淑霞1

(1.河北医科大学 病理教研室，河北 石家庄 050017；2.河北省人民医院医院a.感染管理科；b.免疫风湿科，河北 石家庄 050051；3.河北医科大学第二医院 免疫风湿科，河北 石家庄 050000)

目的 研究泛素特异性蛋白酶46 (Usp46)基因在系统性红斑狼疮(SLE)患者及健康人外周血中的表达水平，并探讨其在SLE发病中的作用。方法 收集73例SLE患者及75 例健康人临床资料，采用Real-timePCR法检测外周血中Usp46基因mRNA的表达情况，分析其表达水平与临床指标的关系。结果 与健康对照组相比，SLE患者血液中Usp46基因的mRNA表达水平明显升高(Z=-6.98，P<0.01)；在SLE患者中Usp46基因的mRNA表达水平与红细胞沉降率(ESR)、IgG、IgM和谷丙转氨酶(ALT)呈正相关(P<0.05)。结论Usp46基因的mRNA表达水平在SLE患者血液中明显增高，提示Usp46基因可能参与SLE疾病的发生发展过程。

红斑狼疮， 系统性；基因；血沉；泛素特异性蛋白酶46

系统性红斑狼疮(SLE)是一种复杂的自身免疫性疾病，累及多系统、多器官，以自身抗体产生、补体激活、免疫复合物沉积以及多种组织器官损伤为特征，病死率极高[1]，是一种严重危害人类健康的常见病。SLE的病因至今未明，发病机制复杂，已有研究表明SLE的发生和发展与激素水平、环境诱因和遗传易感性等多种因素有关[2]。其中免疫系统的过度活化可导致自体抗体的产生、免疫复合物的沉积以及致炎因子的释放，最终引发SLE中各个脏器的损伤[3]。最近研究发现泛素特异性蛋白酶46 (Usp46)基因作为一种去泛素化酶，通过去泛素化PH结构域富含亮氨酸重复蛋白磷酸酶1(PHLPP1)参与调控Akt信号通路[4]，在结直肠癌中发挥着抑癌基因的作用，而且新近研究报道该基因与EB病毒核抗原(EBNA)家族一同参与调控淋巴细胞的生长和分化[5]，可能在免疫系统中发挥重要作用，然而其是否在SLE的发病中发挥作用仍是未知，本研究采用Real-timePCR法检测SLE患者及健康人外周血中Usp46基因mRNA的表达情况，分析其表达水平与临床指标的关系，初步探讨Usp46基因在SLE患者发病中的可能作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2015年1月至2017年1月在河北医科大学第二医院免疫风湿科诊断的SLE患者73例，男7例，女66例，年龄(35.0±2.8)岁。SLE诊断均符合美国2009年风湿病学会修订的诊断标准。选取同期健康献血者75例作为对照，男10例，女65例，年龄(38.0±1.2)岁。两组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。研究对象均已签署知情同意书且已通过伦理委员会批准。

1.2 方法 所有研究对象抽取空腹静脉血用于红细胞沉降率(ESR)、IgA、IgG、IgM、C3、C4及丙氨酸转氨酶(ALT)检测。

1.2.1 总RNA提取及cDNA合成 用PAXgeneBloodRNATubes(Quagen)保存血液，保证血液中RNA的稳定性，运用PAXgeneBloodRNAKit(Quagen)试剂盒提取总RNA，检测其纯度和浓度后，采用FastQuantRTKit(天根)试剂盒反转录合成cDNA，本试验是在河北省肾脏病重点实验室完成。

1.2.2 引物设计 根据Usp46(NM_022832.3)和内参基因GAPDH(NM_002046)基因序列设计引物，由上海生工生物公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.3Real-timePCR检测Usp46基因表达水平 用荧光定量PCR检测仪(AgilentMX3000P，美国)进行PCR扩增，Real-time反应体系由SYBRGreenMix10μl、上游引物和下游引物各0.5μl(终浓度为12.5μM)、cDNA1μl、无RNA酶的去离子水8μl构成20μl体系。反应条件为95 ℃ 2分钟预变性，95 ℃ 5秒，55 ℃ 30秒，72 ℃ 30秒共40个循环，同时检测熔解曲线。确定循环阈值(Ct)后，目标基因Usp46相对于内参基因GAPDH进行相对定量，采用2-△△Ct法计算相对表达量，并比较两组间的基因表达水平的差异[6-7]。PCR扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳以检测基因特异性。

1.3SLEDAI评分对SLE病情的判断依据 0～4分，基本无活动；5～9分，轻度活动；10～14分，中度活动；≥15分，重度活动。

2 结 果

2.1 临床指标SLE患者SLEDAI评分为中度活动；患者存在血液系统、肾脏、皮肤及神经系统损伤；ESR明显加快，高于正常水平；补体C3、C4低于正常水平，见表2。

表2 73例SLE患者临床资料

2.2 血液标本RNA健康对照组RNA浓度为(48.50±5.28)g/L，纯度OD比值为(1.89±0.05)，SLE组RNA浓度为(85.60±7.06)g/L，纯度OD比值为(1.98±0.03)，采用1%琼脂糖凝胶电泳结果显示18s和28s条带清晰，28s的亮度是18s的2倍左右，说明完整性良好。

2.3 实时荧光定量PCR实时荧光定量RCR结果显示扩增良好(图1a)；溶解曲线均为单峰(图1b，左侧为Usp46基因，右侧为GAPDH基因)，将PCR产物进行2.5%琼脂糖电泳结果显示条带单一、大小正确(图1c)。

2.4Usp46基因mRNA表达水平Real-timePCR结果显示，两组均表达Usp46基因mRNA，SLE组Usp46基因的表达水平4.22 (1.30，17.02)健康对照组1.00(0.84，1.11)，两组比较差异有统计学意义(Z=-6.98，P<0.01)。

2.5 相关性分析SLE患者Usp46基因的mRNA表达水平与ESR、IgG、IgM和ALT呈正相关(P<0.05)，与SLEDAI评分、IgA、C3、C4无相关性。见图2。

图1 GAPDH和Usp46基因实时荧光定量PCR结果 a.扩增曲线；b.融解曲线；c.荧光定量PCR产物的琼脂糖电泳结果

图2 SLE患者Usp46基因表达水平与临床指标的相关性

3 讨 论

SLE是目前临床上最常见的自身免疫性疾病，患者血清中常含有多种自身抗体，病变可以累及体内泌尿、神经、循环、运动、呼吸、血液、消化等多个系统，导致患者出现狼疮性肾炎、狼疮性脑病、狼疮性心脏病等多种并发症，严重影响患者的生存质量，如不控制甚至可以威胁患者的生命，然而SLE缺乏早期发现和早期诊断的分子标记物，病情往往进展到并发症阶段，有明显临床症状后才就医，严重影响患者的预后及生活质量，因而寻找早期分子标记物是早诊断、早治疗，提高患者生存质量的关键。

研究发现泛素-蛋白酶体通路[8]通过特异性地降解细胞内的蛋白质参与调控多种细胞进程，包括细胞周期[9]、肿瘤生长[10]及炎症[11]等，而且还参与免疫反应的调控[12-13]，去泛素化酶是该通路中重要的质量控制因子，通过对底物蛋白的去泛素化来调控蛋白质的寿命[14]，去泛素化酶表达水平、基因突变及功能异常与多种自身免疫性疾病的发生发展有关，如肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)基因突变与SLE、风湿性关节炎等自身免疫性疾病、淋巴瘤及哮喘等疾病[15-16]，Usp18通过调控转化生长因子β激活激酶 1(TAK1)及TAB(TAK1 结合蛋白1)在辅助性T细胞17(Th17)分化和自身免疫反应中发挥作用[17]，另外Usp7表达水平增加及活性增强使多种抑癌基因P53、第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)稳定性下降[18]，而且Usp7还参与调控核因子κB(NF-κB)信号通路[19-20]。

Usp46基因为人类100多种去泛素化酶[21]中的一种，属于泛素特异性蛋白酶亚家族，Usp46基因的生理功能目前仍不明确，有研究表明Usp46基因为小鼠“行为抑郁”的责任基因[22-23]，且通过去泛素化谷氨酸受体α-氨基-3 羟基-5 甲基-4 异恶唑受体(AMPAR)调控大脑的兴奋性突触传递[24]，提示Usp46基因很可能参与神经系统疾病的发生发展。此外研究发现其在组蛋白H2A和H2B的去泛素化[25]和大肠癌细胞的Akt信号转导[4， 26]等方面发挥重要作用，而且该基因与EB病毒核抗原3(EBNA3)家族中的EBNA3A和EBNA3C相互作用发挥着调控淋巴细胞的生长和分化的作用[5]，提示该基因很可能在免疫系统中也发挥重要作用，然而其是否在SLE中发挥作用，仍无报道，本研究发现与健康人比较，SLE患者外周血中Usp46基因mRNA表达水平明显升高，提示该基因可能与SLE的发病有关。

那么该基因能否作为SLE早期诊断的分子标记物呢？本研究发现该基因的表达水平与SLE患者多项临床指标存在相关性。ESR是反应炎症的非特异性指标，一般在风湿热、类风湿关节炎、血管炎等结缔组织病的活动期升高，可以作为判断疾病活动及预后的指标，以往研究表明大多数活动期SLE患者ESR增高，而临床缓解期SLE患者ESR基本正常，提示ESR检测可以动态观察SLE患者病情活动的变化[27]。本研究显示Usp46基因mRNA与ESR呈正相关，提示该基因与SLE疾病进展有关。然而其与SLEDAI评分无相关性，可能是样本量较少的原因。

此外，SLE患者早期或活动期会出现血清免疫球蛋白及补体的异常变化[28-30]，当自身抗体与组织有免疫反应出现时，免疫复合物增多，补体系统活化并与免疫复合物结合，在此过程中补体消耗较多，血液中补体成分降低，下降程度与患者病情活动程度相符，因而免疫球蛋白和补体常与自身抗体一起被用于SLE的临床诊断及病情疗效评估。本研究发现Usp46基因的表达水平与IgG、IgM呈正相关，进一步提示Usp46基因可用于SLE患者的病情评价。本研究还发现Usp46基因表达水平与ALT呈正相关，该基因是否与狼疮性肝损伤有关仍有待进一步研究。

总之，本研究发现Usp46基因mRNA表达水平在SLE患者中明显升高，约为健康人群的4.22倍，提示Usp46基因可能与SLE的发病有关，而且与ESR、IgG、IgM呈正相关，进一步提示Usp46基因与SLE的病情进展有关，然而其是否能作为SLE辅助诊断的分子标记物，仍需要进一步扩大样本量进行研究。

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Roleofubiquitin-specificproteases46geneinbloodofpatientswithsystemiclupuserythematosus

ZhangWei1，WeiQun2a，GuoHuifang3，ZhengGuimin2b，ZhangLianzhi1，Pengyuanyuan1，LiuShuxia1

1.DepartmentofPathology，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050017，China; 2a.DepartmentofNosocomialInfectionControl；2b.DepartmentofRheumatology，HebeiGeneralHospital，Shijiazhuang050051，China; 3.DepartmentofRheumatology，theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China

LiuShuxia，Email:susanliu1976@163.com

ObjectiveToinvestigatetheroleofubiquitin-specificproteases46 (Usp46)inthebloodofsystemiclupuserythematosus(SLE)patientsandhealthypopulation.MethodsRealtimepolymerasechainreactionanalysiswasusedtodeterminetheUsp46expressioninthebloodof73patientswithSLEand75healthycontrols.ResultsThemRNAexpressionlevelofUsp46wassignificantlyincreased，about4.22(1.30，17.02)folds，insamplesfromSLEpatientscomparedtohealthypopulation(Z=-6.98，P<0.01).Inaddition，therewassignificantlypositivecorrelationbetweentheexpressionlevelofUsp46andESR，IgG，IgMandALT(P<0.05).ConclusionThemRNAexpressionlevelofUsp46wassignificantlyhigherinSLEpatientsthaninhealthypopulation，whichindicatesthatUsp46mayparticipateinthedevelopmentofSLEprocess.

lupuserythematosus，systemic；genes；bloodsedimentation；ubiquitinspecificprotease46

河北省自然科学基金(H2015206449)；河北省卫生厅重点科技研究计划(ZD20140034)；河北省大学生创新创业训练计划(201510089038)

刘淑霞，Email:susanliu1976@163.com

R

A

1004-583X(2017)08-0686-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.08.010

2017-07-06 编辑:王秋红