液相色谱串联质谱法测定婴幼儿食品中维生素D3的质量浓度

（广东出入境检验检疫局，广州510623）

液相色谱串联质谱法测定婴幼儿食品中维生素D3的质量浓度

林海丹，谢守新，钟钰，刘超，谢玉珊，丁博，邹志飞

（广东出入境检验检疫局，广州510623）

建立了同位素内标液相色谱串联质谱法测定婴幼儿食品中维生素D3质量分数。试样加同位素内标后，乙醇-50%氢氧化钾溶液皂化，石油醚萃取，Atlantis T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），甲醇-5 mmol/L甲酸胺溶液作为流动相，梯度洗脱进行液相分离，采用电喷雾正离子方式，多反应选择离子监测，内标法峰面积定量。婴幼儿食品中维生素D3质量浓度在2～200 μg/L范围内线性良好，相关系数r均大于0.99，配方奶粉和米粉在10，50和100 μg/kg三个质量分数水平的添加回收率分别为86.1%～107%和86.2%～106%,变异系数分别为4.48%～7.08%和2.10%～4.26%(n=6)。方法的定量限为10 μg/kg。方法简便、准确，适用于婴幼儿食品中维生素D3的检测。

液相色谱串联质谱法；婴幼儿食品；维生素D3

0 引言

维生素D是一种脂溶性维生素，与人体健康关系密切的是维生素D2（麦角骨化醇）和维生素D3（胆钙化醇）。婴幼儿食品中通常添加的维生素D3作为必需成分，我国也制定了其使用限量标准[1-3]。

食品中维生素D检测的经典方法是样品经皂化，萃取净化后液相色谱法分析，如我国国标方法[4]，但是乳品中维生素D的含量较低，需采用半制备色谱法纯化、富集后才能满足检测需求，该方法繁琐，同时也可能有基质干扰，可操作性不强。近年来，选择性强、灵敏度高的液相色谱-质谱法[5-7]已有应用于维生素D的检测，如AOAC方法[8]。

本研究采用同位素内标法，高效液相色谱串联质谱测定婴幼儿食品中维生素D3，旨在建立一种简便、准确的定性定量方法。

1 实验

1.1 材料与试剂

甲醇（HPLC级），石油醚，乙醇，无水硫酸钠，氯化钠，氢氧化钾，抗坏血酸，淀粉酶(酶活力≥1 500 U/ g)，维生素D3标准品（纯度≥97%），氘代维生素D3标准溶液（维生素D3-[6,19,19-2H3]），100 mg/L，纯度≥97%）。

用乙醇配制维生素D3标准溶液（质量浓度10 mg/L），使用前需校正，参见GB 5413.9-2010附录A。再用乙醇逐级稀释维生素D3标准溶液配成2～200 μg/L的维生素D3标准工作液，每毫升标准工作溶液含有100 ng的氘代维生素D3。

1.2 仪器与设备

AB 4000 QTRAP串联质谱仪配有电喷雾离子源，岛津液相色谱仪(四元低压梯度输液泵,自动进样器,柱温箱)，AB公司Analyst仪器控制及数据处理软件，分析天平，恒温箱，水浴振荡器，涡旋振荡器，减压旋转蒸发器。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

准确称取1 g试样于50 mL离心管中，加入10 mL约40～50℃的水使，100 μL氘代维生素D3标准溶液（1 mg/L），涡旋混合30 s。淀粉试样需加入0.4 g淀粉酶，涡旋混合30 s，充氮排出空气，盖上瓶盖。放入恒温箱中，60℃培养30 min，取出备用。

于上述处理的试样溶液加入0.4 g抗坏血酸，加12 mL乙醇，涡旋混合30 s，加入5 mL质量分数为50%氢氧化钾水溶液，涡旋混合30 s，充氮排出空气，盖上瓶盖，置于75℃水浴振荡40～50 min，取出立即冷却至室温。用少量饱和氯化钠水溶液将上述皂化液全部转入250 mL分液漏斗中，加入30 mL石油醚，轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，置于分液漏斗振荡仪剧烈振荡3 min，静置分层，收集石油醚层，按上述方法进行第二次萃取，合并石油醚于分液漏斗中，用饱和氯化钠水溶液洗至近中性，石油醚经装有脱脂棉和无水硫酸钠的漏斗过滤至100 mL鸡心瓶中，置减压旋转蒸发仪，40℃蒸干，立即加入乙醇1 mL，涡旋混合30 s，过0.45 μm滤膜后，供液相色谱质谱LC-MS/MS测定。

1.3.2 色谱及质谱条件

色谱柱为Atlantis T3柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；流动相为甲醇(A)-5 mmol/L甲酸胺(B)，0～2min，A为95%；2.01～7min，A为98%；7.01～10 min，A为95%；流速为0.40 mL/min；柱温为40℃；进样量为10 μL。

质谱条件如表1和表2所示。

表1 电喷雾离子源（ESI）的各参数

2 结果与讨论

2.1 同位素的选择

液相色谱质谱定量分析采用同位素内标法，由于同位素的物理，化学性质相近，在样品前处理时加入同位素内标，既校正了回收率又同时有效校正质谱分析时的基质效应。

2.2 样品前处理方法的优化

乳品中维生素D是脂溶性的，经典方法，如国标法和AOAC方法均采用乙醇-氢氧化钾溶液皂化，皂化时添加抗坏血酸保护维生素D，避免氧化，与国标法相比，本方法采用液相色谱串联质谱法检测，灵敏度高，因此本方法减少称样量，抗坏血酸加入改为直接添加固体试剂，减少体系的溶剂体积，这样有利于下一步的皂化。皂化置振荡器中振摇，体积少，更加振动充分，选择气密性好的具塞离心管，避免密封不好带入氧气造成维生素D的氧化损耗。提高皂化温度，实验表明温度提高至75℃，维生素D没损失，而油脂皂化更加彻底，回收率和实际样品的检测结果更为准确。

表2 多反应选择离子监测方式(MRM)的各参数

2.3 质谱条件的优化

比较了APCI和ESI离子源，发现APCI源的维生素D灵敏度和信噪比都不如ESI源，同时对样品采用不同源分析，考察基质干扰，APCI源没有明显改善基质干扰，因此采用ESI电喷雾离子源。

对1 mg/L标准溶液进行母离子和子离子扫描和对其质谱参数优化，结果表明正离子模式监测的灵敏度高。维生素D及其内标的子离子全扫描质谱图见图1-图2。确定的质谱参数后，采用维生素D标准溶液自动进样，进行优化色谱流动相和离子源气体的各参数。当分别用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-5 mmol/L甲酸铵，甲酸铵的响应值相对较高，采用乙腈代替甲醇，响应值没有明显变化。因此选用甲醇-5 mmol/L甲酸铵作为流动相，灵敏度足以满足要求。

图1 维生素D3的子离子扫描质谱

2.4 质谱碎裂机理解析

对维生素D3质谱子离子扫描获得碎片进行解析如图3所示。

2.5 色谱条件的优化

图2 氘代维生素D3的子离子扫描质谱

图3 维生素D3的质谱解析

经质谱条件筛选后选用甲醇-5 mmol/L甲酸铵溶液作为流动相，考察其色谱行为，对样液进行分析，考察峰形，基质干扰等分离问题，试验梯度洗脱条件，确定最佳的洗脱梯度。考察不同色谱柱，维生素D3在很多普通C18色谱柱上都可以得到很好的峰形，考察样液的基质峰与目标峰的色谱分离行为，确定采用waters Atlantis T3柱(100 mm×2.1 mm，粒度3 μm,)，分离效果好。试验梯度洗脱条件，确定最佳的洗脱梯度，维生素D3标准（50 μg/L）及其内标（100 μg/L）的MRM图如图4-图6所示。

图4 维生素D3标准m/z 385.4/259.3离子对色谱

图5 维生素D3标准m/z 385.4/107离子对色谱

图6 标准内标m/z 388.6/259.2离子对色谱

图7 配方奶粉内标m/z 388.6/259.2离子对色谱

图8 配方奶粉m/z 385.4/259.3离子对色谱

图9 配方奶粉m/z 385.4/107离子对色谱

图10 米粉m/z 385.4/259.3离子对色谱

图11 米粉m/z 385.4/107离子对色谱

图12 米粉内标m/z 388.6/259.2离子对色谱

2.6 线性范围

用乙醇配成的一系列质量浓度的标准混合工作溶液按实验的色谱条件进行测定，以分析物与内标物峰面积比(Y)-分析物与内标物质量浓度比(X)作校正曲线，得到线性回归方程Y=1.17X+0.011，维生素D3质量浓度在2～200 μg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99。

2.7 回收率、精密度及定量限

用不含维生素D的婴幼儿配方奶粉（由雀巢公司提供无添加维生素D的配方奶粉）和米粉样品（市售）进行添加回收和精密度实验，维生素D3添加定量限水平的多反应监测(MRM)色谱如图7～图12所示。配方奶粉和米粉在10，50和100 μg/kg 3个质量分数水平的添加回收率分别为86.1%～107%和86.2%～106%,变异系数分别为4.48%～7.08%和2.10%～4.26%(n=6)。方法的回收率和精密度符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》对检测方法确认的技术要求对回收率和精密度的要求，结果见表3。

实验表明样品中维生素D3在添加10 μg/kg水平时，信噪比（S/N）大于10，且回收率和精密度满意，因此以10 μg/kg作为方法的定量限。

表3 婴幼儿食品中维生素D3的添加回收率和精密度(n=6)

2.8 实际样品分析

对含维生素D3的质控样品（美赞臣提供的经全球比对定值的样品）进行测定6次，平均测定值91.0μg/ kg，变异系数为4.30%(n=6)。结果在全球各实验室定值范围（72.3～97.0μg/kg）内。

3 结束语

本方法研究建立了婴幼儿食品中维生素D3的高效液相质谱联用法。方法的样品的前处理简单、易操作、定量准确，适用于婴幼儿食品中维生素D3的检测。与国标法比较，仪器的灵敏度提高了，不需采用半制备色谱的方法可以达到检测的要求，减少试剂的消耗和缩短了检测时间，同时质谱法的定性的准确性高。与其它同类方法比，采用同位素内标定量，有效降低基质效应和校正回收，定量更准确。

[1]GB 10765-2010《食品安全国家标准婴儿配方食品》[S].

[2]GB10767-2010《食品安全国家标准较大婴儿和幼儿配方食品》[S].

[3]GB 10769-2010《食品安全国家标准婴幼儿谷类辅助食品》[S].

[4]GB 5413.9-2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定》[S]

[5]谢玉珊.谢守新.宋阳.液相色谱-质谱联用法测定乳品中维生素D3质量浓度[J].中国乳品工业,2015.43(1):33-35.

[6]霍艳敏.王骏.段文增.HPLC-APCI(+)-MS/MS测定乳制品中的维生素D2及D3[J].分析测试学报,2016.35(3):327-331.

[7]朱姜.张鹏.杨嘉.高效液相色谱_串联质谱法测定奶粉中的维生素A、维生素D、维生素E[J].食品与药品检验,2015.25(11):1733-1735.

[8]AOAC Official Method 2012.11 First,Action 2012《Simultaneous De⁃termination of Vitamins D2and D3in Infant Formula and Adult/Pediat⁃ric Nutritional Formula ESI LC-MS/MS》[S].

Determination of Vitamin D3in foods for infants and young children with iso⁃tope-labeled internal standard by liquid chromatography tandem mass spec⁃trometry

LIN Haidan，XIE Shouxin，ZHONG Yu，LIU Chao，XIE Yushan，DING Bo，ZOU Zhifei
(Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510623,China)

To develop a isotope-labeled internal standard liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）method for the determination of vitamin D3in foods for infants and young children.The sample was inoculated with a isotope-labeled internal standard and saponified with ethanol–50%potassium hydroxide，followed by extraction with petroleum ether.The chromatographic separation was per⁃formed on the Atlantis T3 column(100 mm×2.1 mm，3 μm）,using methanol-5 mmoL/L ammonium formate solution as the mobile phase by gradient elution.The method applied positive electrospray ionization and multiple reaction monitoring mode and quantified with peak ar⁃ea with internal standard method.A good linearity was obtained for 2～2000 μg/L with a correlation coefficient above 0.99.The average re⁃coveries from three different were with the range of 86.1%to 107%and 86.2%to 106%respectively in formula and rice flour at spiked levels of 10,50,100 μg/kg.and the relative standard deviations were between 4.48%to 7.08%and 2.60%to 4.26%respectively(n=6).The limit of quantification was 10 μg/kg.This method is simple,accurate and suitable for determination of vitamin D3in foods for infants and young chil⁃dren.

liquid chromatography tandem mass spectrometry；foods for infants and young children；vitamin D3

TS252.7

：A

：1001-2230（2017）07-0056-04

2017-02-13

林海丹（1970-），女，研究员，主要从事食品化学分析工作。