哈萨克斯坦传统发酵乳制品中乳酸菌的多样性

(内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018)

哈萨克斯坦传统发酵乳制品中乳酸菌的多样性

刘红新，呼斯楞，刘文俊，孙天松

(内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018)

为了阐明哈萨克斯坦传统发酵乳制品中乳酸菌生物多样性，采用传统纯培养方法对采集的5份传统发酵乳制品中的乳酸菌进行分离纯化，运用16S rRNA基因序列分析方法和系统发育树研究进行属种鉴定。结果表明，从5份传统乳制品中分离鉴定了49株乳酸菌分属于4个属8个种或亚种，乳杆菌属（Lactobacillus）44株，片球菌属（Pediococcus）1株、肠球菌属（Enterococcus）3株，链球菌属（Strep⁃tococcus）1株。其中乳杆菌属、片球菌属、肠球菌属、链球菌属是哈萨克斯坦地区传统发酵乳制品中的主要乳酸菌，其中Pediococcus pento⁃saceus为优势菌种，占总分离株的22%。

乳酸菌；传统发酵乳制品；16S rRNA基因序列分析

0 引言

传统发酵乳制品是以乳为原料，在自然开放的环境中，经微生物发酵后，通过不同工艺制作而成的发酵乳制品。包括：酸牛奶、酸马奶、酥油、马奶酒、曲拉、乳酒（以马奶为主）等[1]。传统发酵乳相比于鲜乳，不仅延长了食品的保质期，也具有独特的风味和良好的益生作用，深受广大消费者所喜爱[2]。近几年对我国不同地区传统乳制品中乳酸菌研究均有报道，但对哈萨克斯坦传统乳制品中乳酸菌的研究甚少，而且不够深入。

本论文采用实验室纯培养方法对哈萨克斯坦传统发酵乳制品中的乳酸菌进行分离、纯化，应用16S rRNA基因序列分析方法对分离株进行鉴定，主要对哈萨克斯坦传统发酵乳制品中的乳酸菌多样性进行分析，更好的了解传统发酵乳制品中乳酸菌的组成与种类。

1 实验

1.1 样品来源

本研究中5份奶制品样品由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室的研究人员于2015年6月16日～2015年6月18日在哈萨克斯坦的不同地区采集。样品采集后低温保存，带回实验室进行后续实验。

1.2 培养基与试剂

菌株分离与纯化培养基为MRS固体和MRS液体培养基，M17固体和M17液体培养基，提取DNA所用试剂，PCR扩增和电泳检测所用试剂，酶类，Mark⁃er。

1.3 样品采集

本研究样品来自哈萨克斯坦地区不同加工成品的传统乳制品，将采集的样品置于4℃便携式冰箱中以维持其低温状态，带回实验室进行乳酸菌的分离纯化等实验。

1.4 乳酸菌的分离纯化及保存

乳酸菌计数：采用倾注培养法[3]。将样品混匀，用浓度为0.85%的无菌生理盐水以十倍稀释法[4]对样品进行梯度稀释，选取10-5，10-6，10-7稀释液1 mL于无菌培养皿中（组内做两个平行），分别倾注20～25 mLMRS和M17固体培养基混匀，置于30℃恒温培养箱中厌氧培养48～72 h。菌落形成后进行计数，计数即为每毫升样品的菌落数。

吸取0.2 mL上述不同梯度（10-5，10-6，10-7）的稀释液分别涂布于加有放线菌酮和多黏菌素（1×10-5）的MRS和M17固体培养基上，涂布后置于37℃恒温培养箱中厌氧培养48 h，待菌落形成后，观察并记录菌落形态（颜色、形状、大小、边缘等），随机挑取形态学特征不同的单个菌落，于MRS或M17固体培养基上划线分离2～3次，直至镜检结果为纯的单菌后编号并传代。选取革兰氏阳性、过氧化氢阴性的纯培养物，加入质量分数为0.1%谷氨酸钠的脱脂乳保护剂，分装混匀后置于-80℃保存备用。

1.5 总DNA的提取及纯度的检测

纯化好的菌株采用液氮反复冻融-CTAB法提取乳酸菌基因组DNA[5-6]。再用ND-1000型微量紫外分光光度计测其浓度和纯度。再用质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.616 S rRNA基因的PCR扩增

PCR扩增16S rRNA基因的引物采用细菌通用引物[7]，引物序列为：

FA-27F：5'-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGA AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，

RA-1495R：5'-AGCGGATCACTTCACACAG GACTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。

扩增体系：5 μL10×EasyTaq Buffer(+Mg2+)；4 μL High Pure dNTPs（2.5 mmol/L）；1.5 μL引物FA-27F（浓度10 mmol/L）；1.5 μL引物RA-1495R（10 mmol/L）；0.5 μL EasyTaq DNA polymerase（5 U/μ L）；2 μL DNA模板（质量浓度100 ng/μL）；35.5 μL ddH2O。

PCR扩增循环参数为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环；72℃末端延伸10 min[8]。

扩增完毕后，取约2 μL的PCR扩增产物用质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，若在1 500 bp处有清晰的扩增条带且无拖尾、弥散现象，则PCR扩增成功。将PCR扩增产物送往上海美吉生物公司进行纯化和DNA测序。

1.7 同源性分析

将测序得到的DNA序列运用DNA Star 5.01软件中的SepMan模块，对所测得菌株的两条16S rRNA基因序列进行整理、拼接、校准，得到1 450 bp左右的有效序列，再利用NCBI中的BLAST（http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）将拼接好的序列与数据库中已鉴定的乳酸菌16S rDNA序列进行同源性比对，将待鉴定菌株序列与同源性最高的模式菌株序列应用MEGA 5.0（http://www.megasoftware.net）软件构建系统发育树，进行遗传进化研究。

2 结果分析与讨论

2.1 乳酸菌的计数结果

活菌数是乳制品样品新鲜程度的重要指标。由表1可知，哈萨克斯坦传统乳制品样品活菌数在4.95～7.67 mL-1（对数值）之间，平均值为6.34±0.05 mL-1（对数值）。其中驼奶、酸马奶高于106mL-1，符合新的酸奶国家标准。杨吉霞等人[9]研究了西藏、云南、新疆3个地区奶酪中的乳酸菌活菌数分别为3.74～4.60，3.62～4.98，3.31～4.49 mL-1（对数值）。杨彦荣等[10]在自俄罗斯卡尔梅克共和国奶酪样品中乳酸菌数为6.64～9.05 mL-1（对数值）。呼斯楞等人[11]对内蒙古呼伦贝尔传统乳制品进行分析研究乳酸菌活菌数在6.80～9.00 mL-1（对数值）之间。Bao Qiuhua[12]对四川曲拉进行研究，活菌数为（7.18±1.49）mL-1（对数值）。由此可见哈萨克斯坦地区乳制品的新鲜程度比较高。

表1 哈萨克斯坦传统乳制品中乳酸菌活菌计数结果

2.2 乳酸菌的鉴定

2.2.1 乳酸菌分离株的菌落形态及表型特征

根据乳酸菌的形态学特征[13-14]，初步从4份传统乳制品样品中共分离出49株疑似乳酸菌的菌株。在MRS和M17固体培养基上菌株的菌落呈圆形，中等大小，凸起，乳白色，湿润，边缘整齐，有些菌落表面光滑有些粗糙。经过革兰氏染色、过氧化氢酶反应，均为革兰氏阳性，过氧化氢阴性菌。初步将49株菌定为乳酸菌。

2.2.2 菌种DNA提取和16S rRNA扩增结果

DNA浓度和OD260/280的测定：OD260/280值在1.8～2.0间即为纯DNA样品。将其质量浓度稀释至100 ng/μL后对乳酸菌分离株16S rRNA基因进行扩增。经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，可以观察到在大约1 500 bp的位置处有一条清晰明亮的条带，并且无弥散现象，无明显非特异扩增现象。

图1 部分分离菌16S rRNA基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

这表明菌株的16S rRNA基因扩增产物可以满足测序的要求。将16S rRNA基因扩增产物送于上海美吉生物科技有限公司进行测序。所有的16S rD⁃NA序列都与GenBank数据库中的模式株有99%及以上的相似度。

2.2.3 系统发育树的构建和乳酸菌鉴定结果

将测序获得的16S rRNA基因序列通过NCBI数据库中BLAST进行同源序列比对分析，以与模式菌株序列同源性大于98%为种的鉴定阈值，将49株分离株鉴定为乳酸菌的4个属，8个种。部分分离株与模式株系统发育树如图2所示。

图2 哈萨克斯坦地区代表性分离株的16S rRNA基因序列的系统发育树

由图2可以看出，IMAU95170(KU555483)、IMAU 95157(KU555493)与模式菌株Lactobacillus brevis ATCC 14869聚为一类，且同源性为100%，故将其鉴定为Lac⁃tobacillus brevis。菌株IMAU95177(KU555498)、IMAU9 5172(KU555504)与模式菌株Pediococcus pentosaceus DSM 20336(T)聚为一类，且同源性为100%，因此可将其鉴定为Pediococcus pentosaceus。菌株IMAU95148 (KU555495)、IMAU95152(KU555481)与模式菌株Lac⁃tobacillus plantarum ATCC 14917(AJ965482)聚为一类，且同源性为99%，故将其归为Lactobacillus plantarum。菌株IMAU95145(KU555491)与模式菌株Lactobacillus crustorum LMG 23699T聚为一类，且同源性高达100%，因此可将其归为Lactobacillus crustorum。菌株IMAU95140(KU555436)、IMAU95181(KU555455)与模式菌株Lactobacillus helveticus(AM113779)聚为一类，且同源性高达100%，故将其鉴定为Lactobacillus helveti⁃cus。菌株IMAU95149(KU555457)、IMAU95186 (KU555488)与模式菌株Enterococcus faecium 1ATCC 19434聚为一类，且同源性达到99%，因此鉴定为En⁃terococcus faecium。IMAU95187(KU555511)与模式菌株Streptococcus thermophilus ATCC 19258聚为一类，同源性达到100%，故将其归为Streptococcus thermophilus。

2.3 优势菌种分析

哈萨克斯坦地区传统发酵乳制品中乳酸菌的分离结果见表2。由表2可知，5份传统发酵乳制品中分离出的49株乳酸菌疑似菌株，经16S rDNA序列测定和同源性分析鉴定，分属于4个属8个种或亚种。5份样品均分离到Pediococcus pentosaceus，共11株，占总分离株的22%，为五份哈萨克斯坦地区的优势菌种。其中HSK1、HSK2、HSK4样品分离出Lactobacillus helveticus，且共分离出16株，占总分离株的33%，说明Lactobacil⁃lus helveticus为哈萨克斯坦地区HSK1、HSK2、HSK4样品中乳酸菌的优势菌种。由表2还可以看出，HSK5（奶酪）分离的菌种类别最多，分别为Lactobacillus plan⁃tarum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus crustorum、Pediococcus pentosaceus、Enterococcus faecium。其次为HSK4（奶酪），分别为Lactobacillus helveticus、Lactobacillus plantarum、Lac⁃tobacillus brevis、Pediococcus pentosaceus。由于本次采样样品比较少，而且没有定点、全面采样，可能是HSK1（酸驼奶）和HSK2（酸马奶）分离的菌种类别较少的原因，以后研究进行改善。综上所述，本研究的5份传统发酵乳制品中优势菌种为Pediococcus pentosaceus，占总分离株的22%。

表2 哈萨克斯坦地区传统乳制品中乳酸菌的分离结果

3 结论

本研究从哈萨克斯坦地区采集的5份传统发酵乳制品样品中乳酸菌数为4.95～7.67 mL-1（对数值），乳酸菌含量都比较高。5份乳样品中共分出49株菌，经鉴定分别归属于Streptococcus thermophilus、Enterococcus faecium、Pediococcus pentosaceus、Lactobacillus plantarum、Lac⁃tobacillus brevis、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus helveti⁃cus、Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus 8个种或亚种。其中Pediococcus pentosaceus为哈萨克斯坦地区传统发酵乳制品中的优势菌种，占总分离株的22%。

4 讨论

4.1 研究方法的可靠性

16S rRNA基因序列分析方法在乳酸菌分离鉴定中应用较多，近几年，随着核酸测序技术的发展，越来越多的16S rRNA基因序列被输入数据库，有大量的数据和强大的数据库作支持。本文采用16S rRNA基因序列分析方法对不同样品中乳酸菌进行分离鉴定，与传统生理生化方法相比，此方法更为可靠[15]。

4.2 菌种分析

本研究的5份传统发酵乳制品中优势菌种为Pediococcus pentosaceus，而Aydemir等[16]所研究的奶酪中优势菌为Lactobacillus casei和Lactobacillus plantarum；Watanabe等[17]和Takeda等[18]对内蒙古自然发酵牛乳进行研究，结果表明，德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lac⁃tobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)是蒙古国自然发酵牛乳的优势乳酸菌菌群。Airidengcaicike等[19]对西藏藏南和藏北地区发酵酸牛乳进行分析研究，分析表明在寒冷的藏北那曲、拉萨地区以发酵乳杆菌(Lactoba⁃cillus fermentum)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)为优势菌群。前人也曾报道，当环境酸度较高时，乳酸球菌的生长受到抑制[20-21]，所以戊糖片球菌多数在酸腌菜、泡菜、青贮料等中分离得到，和本文分离的结果存在差异，可能与当地的气候、环境、发酵温度和发酵时间以及制作方法等因素有关。本研究对传统发酵乳制品进行多样性分析，这对丰富我国乳酸菌菌库很有帮助，为乳酸菌资源开发与研究奠定良好的基础。

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Survey of diversity of Lactic acid bacteria in traditional fermented milk products from Kazakhstan

LIU Hongxin，HU Sileng，LIU Wenjun，SUN Tiansong
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Ministry of Education,Inner Mongolia Agricultural Universi⁃ty,Huhhot 010018,China)

The aim of this paper is to research the diversity of Lactic acid bacteria in traditional fermented milk products from Kazakhstan.Lactic acid bacteria were isolated and purified by traditional pure culture form traditional fermented milk products samples,and then all isolates were identified by 16S rRNA gene sequence analysis.A total of 49 strains of Lactic acid bacteria were classified into 4 genera and 8 species or subspe⁃cies,namely Lactobacillus(44 strains),Pediococcus(1 strains),Enterococcus(3 strains),Streptococcus(1 strain).Pediococcus pentosaceus was regarded as the dominant species,occupied 22%of the total isolates.

Lactic acid bacteria；traditional fermented milk products；16S rDNA sequence analysis

TS252.54，Q939.11+7

：A

：1001-2230（2017）07-0009-04

2016-09-06

国家科技支撑计划项目（2013BAD18B01）；国家自然科学基金课题（31471711）。

刘红新（1991-），女，硕士研究生，研究方向为微生物生理与发酵工艺。

孙天松