牦牛酸乳特色发酵剂的研发

（西南大学食品科学学院，重庆400715）

牦牛酸乳特色发酵剂的研发

张靖晞，廉桂芳，索化夷

（西南大学食品科学学院，重庆400715）

通过对传统发酵牦牛酸乳中分离、鉴定的17株马克斯克鲁维酵母菌进行性能筛选，选出乳糖利用率高、产胞外多糖能力强、耐酸性的一株马克斯克鲁维酵母菌。它与实验室保存的发酵性能良好的干酪乳杆菌和嗜热链球菌组合发酵，并通过单因素试验、正交试验以确定最佳发酵条件。结果表明最佳发酵条件：菌液（浓度为1×109mL-1）体积比干酪乳杆菌∶嗜热链球菌∶马克斯克鲁维酵母菌为1∶1∶4，接种量为4%，发酵温度为35℃，加糖量为4 g/100 mL，此时感观评分达到89.20分，滴定酸度达到94.420T，综合评定值为0.775。

马克斯克鲁维酵母；乳糖利用率；产胞外多糖能力；耐酸性；组合发酵

0 引言

牦牛在我国主要分布于青藏高原地区，素有万能畜种之称[1]。牦牛酸乳属于Ⅳ型发酵乳，其由乳酸菌和酵母菌共同发酵而成。酵母菌可提高乳制品的风味[2],其与乳酸菌的共生作用使发酵乳具有稳定的特性[3-4]。同时酵母菌的参与还可抑制有害菌的生长[5-6]。

马克斯克鲁维酵母作为传统发酵牦牛酸乳的重要酵母菌，对牦牛酸乳的风味品质有重要影响。

本实验通过对实验室保存的马克斯克鲁维酵母菌进行性能筛选，筛选出乳糖利用率高、产胞外多糖能力强、耐酸性的一株目标菌株，并与实验室保存的干酪乳杆菌和嗜热链球菌组合发酵，通过正交试验确定最佳发酵条件，从而发酵出具有特色风味的牦牛酸乳，为进一步认识利用并开发出有自主产权的传统酸乳发酵剂提供一定参考。

1 实验

1.1 菌种

采自于西藏羊八井地区传统发酵的牦牛酸乳中，经分离、纯化、鉴定并保存于甘油中的17株马克斯克鲁维酵母菌菌株（1-1，4-1，6-1，8-1，10-1，13-1，16-1，18-1，19-1，20-1，23-1，25-1，30-1，31-1，32-1，33-1，34-1）；西南大学食品科学学院保藏干酪乳杆菌28-2(发酵性能为：产胞外多糖量质量浓度为76.93mg/L,产双乙酰的质量浓度为5.09 mg/L，产乙醛的质量浓度为23.76 mg/L，嗜热链球菌H3-3 906,西南大学食品科学学院保藏。

1.2 试剂

PDA马铃薯葡萄糖琼脂，YPD培养基，MRS固体培养基，MRS肉汤，均为BR生物试剂；乳糖，氢氧化钠，苦味酸，苯酚，亚硫酸氢钠，硫酸锌，氢氧化钡，三氯乙酸，浓硫酸，葡萄糖，均为分析纯；牦牛奶粉,乳制品。

1.3 仪器设备

电热恒温鼓风干燥箱（DGG-9140A），可见分光光度计（722），PH计（PHS-3C型），磁力搅拌器（78-1），无菌操作台（SW-CJ-2F），离心机（5810）。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌的活化

先取150 L保存于甘油中的菌液于5 mL YPD液体培养基中，捆扎好于摇床上28℃，转速为220 r/min培养24 h。再按3%接种量（150 μL）接种于5mL液体培养基中，捆扎好于摇床上28℃，转速为220 r/min培养24 h。最后将活化的菌液无菌条件下划线接种于PDA固体培养基（经121℃，20 min杀菌）中，用无菌封口胶带纸封好，倒置于恒温培养箱中，28℃培养48 h。

1.4.2 乳糖利用率的测定

配制乳糖标准液并绘制标准曲线。使用接种环无菌条件下挑起一环于平板中生长完好的单菌落转移至5 mL YPD液体培养基中，28℃培养24 h。取3%的接种量（150 L）于5 mL质量浓度为120 g/L的脱脂乳中（115℃灭菌15 min），28℃培养24 h，取出测定其乳糖含量B。留一组未接种菌液的5 mL脱脂乳做同样处理，作为脱脂乳乳糖含量的测定,测定结果为A。乳糖利用率为：

1.4.3 产胞外多糖能力

参照刘烺新[8]提取胞外多糖的方法，得到沉淀后的胞外多糖。将胞外多糖溶于10 mL蒸馏水中，得到EPS的水溶液。再根据硫酸-苯酚法测定酵母菌胞外多糖（EPS）的含量。

1.4.4 耐酸能力

用接种环取已在平板上活化的菌种一环，接种于5 mL YPD液体培养基中，28℃下培养24 h，再按3%（150 μL）的接种量分别接种于已灭菌的pH值分别为2.0，3.0，4.0的5 mL YPD液体培养基中，28℃恒温培养24 h。同时以pH值为5.5的YPD液体培养基作空白对照，每个监测点作3次重复。采用平板菌落计数法来测定菌株存活率，以此来判断菌株的耐酸能力。存活率为

式中：C处理为经处理后的培养基上所得活菌数（mL-1）；C对照为对照组的培养基上所得活菌数（mL-1）。

1.4.5 发酵乳发酵流程[9]

牦牛奶粉120 g/L（质量浓度）→杀菌（110℃，10 min）→冷却→接种→适温发酵→冷却→冷藏后熟（4℃,24 h）→成品。

1.4.6 牦牛酸乳发酵工艺条件优化

（1）牦牛酸乳发酵菌株配比的单因素实验。按1.4.5的发酵流程和预实验结果，添加4 g/100 mL的白砂糖，将菌种分别以3∶3∶2，1∶1∶1，1∶1∶2，1∶1∶4，1∶1∶6，1∶1∶8（干酪乳杆菌∶嗜热链球菌∶马克斯克鲁维酵母菌）的体积比，以3%的接种量接种发酵，37℃发酵至凝固，在冷藏后熟后取样测定滴定酸度，感官评价其风味效果，选择适宜的菌株配比水平。

（2）牦牛酸乳发酵接种量的单因素实验。按照1.4.5的发酵流程和预实验结果，用组合菌株1∶1∶2的菌种体积比，添加4 g/100 mL的白砂糖，分别以1%，2%，3%，4%，5%，6%的菌种量接种；37℃发酵至凝固，记录时间，冷藏后熟后取样测定滴定酸度，感官评价其风味效果，选择适宜的接种量水平。

（3）牦牛酸乳发酵温度单因素实验。按照1.4.5的发酵流程和预实验结果，添加4 g/100 mL的白砂糖，用组合菌株1∶1∶2的菌种体积比，以3%的接种量接种发酵，分别在29，31，33，35，37，39℃的温度条件下发酵至凝固，记录时间，冷藏后熟并取样测定滴定酸度，感官评价其风味效果，选择适宜的发酵温度水平。

（4）牦牛酸乳发酵加糖量的单因素实验。按照1.4.5的发酵流程和预实验结果，用组合菌株1∶1∶2的菌种体积比，分别添加质量浓度为（2，3，4，5，6，7）g/ 100 mL的白砂糖，以3%的接种量接种，37℃发酵至凝固，记录时间，在冷藏后熟后取样测定滴定酸度，感官评价其风味效果，选择适宜的加糖量水平。

1.4.7 牦牛酸乳发酵工艺的正交试验设计

选取菌液体积比（A）、接种量（B）、发酵温度（C）、加糖量（D）单因素试验较优的发酵条件设计正交试验因素水平表，在此基础上，以滴定酸度和感官评分作为评定指标，采取L9（34）正交实验来确定最优的发酵工艺条件。采用多指标正交试验的变异系数分析方法[10-11]对滴定酸度和感官评分两个指标进行计算得出综合评定值。从而确定最佳发酵工艺参数。

1.4.8 酸乳样品指标的测定

（1）滴定酸度的测定。以GB/T 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》[12]中对酸度的测定方法为标准,利用浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液对发酵乳后熟24 h的酸度进行滴定。

（2）感官评价方法。将凝固后的发酵乳置于4℃冷藏24 h后，由经过专业感官评价训练的评审员10人对牦牛酸乳的色泽、气味和滋味、组织状态进行感官评价，评定标准如表1和表2所示。

表1 发酵乳感官评价评分[16-17]

2 结果与分析

2.1 乳糖含量测定结果

以吸光度值为纵坐标，乳糖浓度为横坐标，得到线性回归方程：为Y=0.4236X+0.0044，R2=0.9977(Y为吸光度Abs,X为乳糖质量浓度mg/mL)。

经测定表明，不同菌株乳糖利用能力有所不同。由表3可以看出，实验菌乳糖利用能力介于10.24%～71.69%之间。乳糖利用率越高，表明实验菌株乳糖利用能力越强，在发酵乳产品中对风味和组织的影响程度越高。因此根据表3，初步筛选出9株乳糖利用率在50%以上的试验菌株，分别为1-1，6-1，8-1，16-1，23-1，25-1，30-1，33-1，34-1。

表2 发酵乳气味和滋味感官评价评分[13-14]

表3 17株菌乳糖利用率%

2.2 产胞外多糖含量测定结果

以吸光度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，得到线性回归方程为Y=0.0067X+0.0065，R2=0.998(Y为吸光度Abs,X为葡萄糖浓度μg/mL)

表4 9株菌产胞外多糖质量浓度μg/mL

胞外多糖可以提高乳制品的组织状态。由表4知，不同菌株产胞外多糖产量不同，9株试验菌中，产量较高的菌有：1-1，6-1，30-1和33-1；产量分别为60.52，72.91，72.62，71.27 μg/mL。Lin等[15]认为发酵时间是影响胞外多糖产量、分子量和组成的重要环境因素，向低脂脱脂牛奶中添加干酪素水解物能显著促进细胞的生长和提高胞外多糖的产量。Welman[16-17]等认为培养基的成分（碳源和氮源）、生长条件（温度、pH值、培养时间）等都可能影响乳酸菌胞外多糖的产量。不同营养和环境条件下产生的多糖的化学结构和生理功能也有差异。

由此可见，菌株产胞外多糖能力除了与培养条件及营养物质的组成有关外，菌株的不同也是影响菌株产胞外多糖能力的关键因素。根据表4，选出4株产胞外多糖产量相对高的菌株1-1，6-1，30-1，33-1进行耐酸性实验。

2.3 耐酸性实验结果

表5 实验菌株在不同酸性条件下的存活率%

菌株的耐酸性越强，越有利于酸乳的发酵，从而使酸乳产生独特的风味和香气。由表5可以看出，在pH4.0的酸性条件下，4株菌的存活率都超过了50%；在pH3.0的酸性条件下，各菌株的存活率都大幅下降；在pH2.0的酸性条件下，1-1，6-1，33-1已经不能生长；只有30-1有一定存活率，说明30-1耐酸性能力强于1-1，6-1和33-1。

根据乳糖利用率、产胞外多糖含量以及耐酸性能力三个指标从而得出性能良好的马克斯克鲁维酵母菌30-1，并与干酪乳杆菌和嗜热链球菌组合发酵并进行发酵工艺条件的优化。

2.4 牦牛酸乳发酵工艺条件的单因素实验

2.4.1 菌种体积比例的影响

图1 不同菌种体积比的发酵乳发酵后熟24 h酸度和感官评分

菌种体积比的改变，对后熟24 h的发酵乳的酸度和感官评分有重要影响。由图1可以看出，当菌种比例为1∶1∶4时，其感官评分为90.8，达到最大，此时滴定酸度为86.4oT，酸度适中。随着菌种体积比的改变（酵母菌含量的相对增加），滴定酸度和感官评价呈现先上升后下降的趋势。可能的原因是马克斯克鲁维酵母可产生高活性的β-半乳糖苷酶，它是一种乳糖酶，其可以催化乳制品中乳糖的水解，使乳糖消耗，乳酸生成。乳酸含量对酸乳的滴定酸度和感官评分至关重要。但当乳酸含量过高时，导致口感偏酸，感官评分降低。由此初步确定菌种配比选取1∶1∶2，1∶1∶4与1∶1∶6。

2.4.2 接种量的影响

接种量的改变，对后熟24 h的发酵乳的酸度和感官评分有重要影响。由图2可以看出，随着接种量的增加，滴定酸度和感官评价呈现先上升后下降的趋势。当接种量为4%时，其感官评分最高为89.3。可能的原因是当接种量较低时乳酸菌含量较低，在相同的发酵时间内，乳酸菌发酵产生的乳酸较少，导致酸度不够，同时pH值较大，导致无法使乳中的酪蛋白凝固，乳清析出较多，感官评分较低。随着接种量的增加，乳酸菌含量增加，滴定酸度和感官评分也随之增加。当乳酸菌含量过高时，在相同的发酵时间内，乳酸菌发酵产生的乳酸过多，导致酪蛋白凝固过快，口感粗糙，口感偏酸，感官评分降低。由此初步确定接种量配比选取3%、4%、5%。

图2 不同接种量的发酵乳发酵后熟24 h酸度和感官评分

2.4.3 发酵温度的影响

发酵温度的改变，对后熟24 h的发酵乳的酸度和感官评分有重要影响。随着温度的增加，发酵乳的酸度呈递增趋势。干酪乳杆菌的最适生长温度为37℃，嗜热链球菌的最适生长温度为40℃，随着温度的上升，逐渐接近其最适生长温度，产生的乳酸量增加，从而酸乳的酸度增加。随着酸度的逐渐增加，感官评分下降，主要原因是酸度太高，口感不适，从而影响感官评价的分数。由图3可以看出，当温度为35℃，其感官评分值最高，在此条件下产生的酸乳凝乳均匀，无乳清析出，酸度适中。因此，初步确定发酵温度选取33，35，37℃进行正交实验。

图3 不同发酵温度的发酵乳发酵后熟24 h酸度和感官评分

2.4.4 加糖量的影响

蔗糖添加量是影响感官评分的一个很重要的因素。添加蔗糖可以缓和酸度，改善风味，提高口感质量。由图4可以看出，随着糖量的增加，感官分值呈先增后降趋势。当糖量增加到4%时，感官分值达到最大值88.9；而当蔗糖添加量超过4%时，感官分值则下降。这是由于当糖量较多时，酸奶的酸度过大，致使酸奶的香味逐渐变淡而甜味逐渐增加，掩盖了酸奶的风味，直接影响对产品的感官分值。而随着加糖量的增加，滴定酸度呈逐渐下降的趋势，可能原因是过多糖量的加入，使水分活度降低，并增加了溶质的反渗透作用，因而影响菌种的发酵，从而酸度降低。由此初步确定加糖量为3，4，5 g/mL进行正交实验。

2.5 酸乳发酵条件的正交实验

图4 不同加糖量的发酵乳发酵后熟24 h酸度和感官评分

在单因素试验基础上，以菌液体积比（A）、接种量（B）、发酵温度（C）、加糖量（D）单因素试验为探讨因素，以滴定酸度和感官评分为评定指标，进行四因素三水平的正交实验，正交实验结果与分析如表6所示。

由表6正交试验极差R可知，4个影响酸奶发酵的因素由大到小的顺序为B＞A＞C＞D，即接种量影响最大，菌种比例次之，加糖量影响最小。由K值可知，各水平的影响顺序为A2＞A3＞A1，B2＞B1＞B3，C2＞C3＞C1，D2＞D1＞D3。由正交试验结果直观分析可知，理论优化的最佳组合为A2B2C2D2，这与综合评分值最高的第4组实验A2B2C3D1结果不一致，因此需要做验证试验。

2.6 验证实验

将理论优化的最佳组合A2B2C2D2和第4组实验A2B2C3D1进行实验验证，得到滴定酸度值和感官评分值，并进行综合评定值的计算，从而确定最佳的优化方案，结果如表7所示。

由表7可以看出，理论优化方案A2B2C2D2综合评定值较A2B2C3D1高，即最佳的优化方案为A2B2C2D2。而此时的优化条件为菌种比例1∶1∶4，接种量为4%，温度为35℃，加糖量为4 g/100 mL。按此条件下发酵的酸乳凝固均匀，组织结构光滑细腻，无乳清析出，具有浓郁的酸奶风味。

3 结论

通过乳糖利用率、产胞外多糖能力、耐酸性三项指标筛选出具有优良发酵性能的一株马克斯克鲁维酵母菌30-1，并与干酪乳杆菌、嗜热链球菌组合发酵，在单因素试验的基础上，通过正交试验分析确定发酵乳最佳发酵工艺条件为：V干酪乳杆菌∶V嗜热链球菌：V马克斯克鲁维酵母菌=1∶1∶4，接种量为4%，发酵温度为35℃，加糖量为每百毫升4 g。在此生产条件下生产的酸乳组织状态均匀细腻，酸度适中，气味浓郁，感观评分达到89.20分，滴定酸度达到94.420T，综合评定值为0.775。该试验方法所得到的最佳生产工艺使酸乳的品质和风味都有了一定的提高。

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表6 酸乳发酵工艺的L9（34）正交实验

表7 验证实验

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Research on special fermentation agent of yak yoghurt

ZHANG Jingxi,LIAN Guifang,SUO Huayi
(Food Science Department,Southwest University,Chongqing 400715，China)

By selecting the capabilities of 17 Kluyveromyces marxianus which were separated and identified from the yak yoghurt fermented with traditional method,we acquired 1 Kluyveromyces marxianus which had the best ability to utilize lactose,produce exopoly saccharides and resist acid.Then we fermented yogurt with this Kluyveromyces marxianus,Lactobacillus casei 28-2 and Streptococcus thermophilus H3-3 906, which were saved in the laboratory,to determine the optimum fermentation conditions by single factor tests and orthogonal experiments. The results showed that the optimal fermentation conditions were as follows:the volume ratio of bacteria and saccharomycetes(the concentra⁃tion of the three microorganisms all is 1×109mL-1)is 1∶1∶4(Lactobacillus casei/Streptococcus thermophilus/Kluyveromyces marxianus),the inocula⁃tion amount is 4%,the fermentation temperature is 35℃，the amount of sugar is 4 g/100 mL.Under these conditions,the titratable acidity of the fermented yogurt reached 94.42oT and the sensory score was 95.

Kluyveromyces marxianus;the ability to absorb lactose;the ability to produce exopoly saccharides;the ability to resist acid;fermen⁃tation combination.

TS252.56

：A

：1001-2230（2017）07-0013-05

2016-11-03

国家公益性行业（农业）科研专项(201303085)；重庆市社会民生科技创新专项(cstc2015shmszx80021)；中央高校基本业务费项目(xdjk2016A018)。

张靖晞（1996-），女，本科，研究方向为食品科学。

索化夷