甘肃地区碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌产NDM-1型碳青霉烯酶情况分析

刘志武,姚立琼,徐腾飞,贾永娟,赵多爱,田文成,汪晓强

(1.兰州大学第一医院检验科，兰州 730000；2.兰州市第一人民医院检验科，兰州 730046；3.金昌市第一人民医院检验科，甘肃金昌 737109；4.张掖市中医院检验科，甘肃张掖 734000；5.康乐县人民医院检验科，甘肃临夏 731500)

·调查研究·

甘肃地区碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌产NDM-1型碳青霉烯酶情况分析

刘志武1,姚立琼1,徐腾飞1,贾永娟2,赵多爱3,田文成4,汪晓强5

(1.兰州大学第一医院检验科，兰州 730000；2.兰州市第一人民医院检验科，兰州 730046；3.金昌市第一人民医院检验科，甘肃金昌 737109；4.张掖市中医院检验科，甘肃张掖 734000；5.康乐县人民医院检验科，甘肃临夏 731500)

目的 调查研究甘肃地区产NDM-1型碳青霉烯酶肠杆菌科细菌现状,为临床感染防控提供依据。方法 收集甘肃地区8家医院2015年至2016年临床分离的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌65株，采用Vitek 2 Compact细菌鉴定仪鉴定到种,K-B纸片扩散法进行药敏试验,E-test法检测碳青霉烯类药物最低抑菌浓度(MIC)值，采用改良Hodge、E-test法测金属酶和改良碳青霉烯类灭活试验(mCIM)筛选blaNDM-1基因耐药表型,PCR特异性扩增blaNDM-1基因,并对扩增产物进行测序和BLAST比对分析。结果 65株实验菌株中有39株在280 bp处扩增出blaNDM-1基因目的条带,经测序和阳性结果比对证实为blaNDM-1基因，其阳性率为60%；65株实验菌改良Hodge、E-test金属酶和mCIM试验阳性率分别为75.38%、70.77%、98.46%；39株blaNDM-1基因阳性肠杆菌科细菌改良Hodge、E-test金属酶和mCIM试验阳性率分别为74.36%、100%、100%。结论 甘肃地区肠杆菌科细菌blaNDM-1基因检出率较高,医院应加强防控。

甘肃；碳青霉烯酶；blaNDM-1；肠杆菌科

新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1)是一种新的β内酰胺酶，该酶可以水解单环类以外的一大类β-内酰胺类抗生素。巯基化合物、EDTA及菲咯啉等络合剂可抑制这类金酶的活性。但常见的β-内酰胺酶抑制剂如舒巴坦、克拉维酸不能抑制其活性[1]。目前,含此酶的细菌往往广谱耐药,除对替加环素和多黏菌素仍敏感外,几乎对所有抗生素耐药[2],尤其对碳青霉烯类抗菌药物耐药，给临床抗感染治疗带来重大困难。本研究对甘肃地区碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌进行blaNDM-1基因检测,了解blaNDM-1基因的流行情况,为临床治疗和防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集甘肃地区2015年至2016年8家医院(三级医院4家、二级医院4家)患者标本中分离出的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌共65株,按照美国临床实验室和标准化协会(CLSI)M100-S27指南[3]判读,即亚胺培南、美罗培南抑菌圈直径≤19 mm,厄他培南抑菌圈直径≤18 mm,满足任一条件即为试验菌株，剔除同一患者的重复菌株，包括大肠埃希菌12株、肺炎克雷伯菌20株、阴沟肠杆菌21株、弗劳地柠檬酸杆菌7株、产酸克雷伯菌5株；标本来源包括痰39株、血液6株、胆汁5株、尿液6株、引流液4株、脓液2株、胸腹水3株。阳性对照菌株为我院2010年分离的1株产酸克雷伯菌[4]，经测序证实为携带blaNDM-1基因，阴性对照菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。

1.2 主要试剂及仪器 药敏纸片(英国Oxoid公司),包括厄他培南、美罗培南、亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、氨曲南、氨苄西林/舒巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢吡肟、头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢他啶、头孢西丁、复方磺胺甲噁唑、四环素、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸、头孢唑林、头孢呋辛；厄他培南、美罗培南、亚胺培南及金属酶E-test条(英国Oxoid公司)； ExTaq Mix及DNA marker 2000(大连宝生物公司)；Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定仪及配套GN鉴定卡(法国生物梅里埃公司)；PCR基因扩增仪(美国Perrin Elmer公司)；Quantity-one凝胶扫描成像系统(美国Bio-Rad公司)；DYY-m电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.3 菌株鉴定及药敏 所有实验菌株全部采用Vitek 2 Compact全自动鉴定仪鉴定到种；K-B纸片扩散法测定抗菌药物抑菌圈直径；E-test法测定厄他培南、亚胺培南、美罗培南的最小抑菌浓度(MIC)，根据CLSI M100-S27标准进行判读,亚胺培南、美罗培南最低抑菌浓度(MIC)≥4 μg/mL,厄他培南最低抑菌浓度(MIC)≥2 μg/mL,符合任一条件即可判定碳青霉烯类耐药。

1.4 改良Hodge试验[3]根据CLSI 2017版M100S-27指南推荐的方法，调0.5麦氏浊度单位大肠埃希菌ATCC 25922,稀释10倍后均匀涂于M-H平板,平板中间贴厄他培南(10 μg)纸片,自纸片外缘向平板边缘划线接种待检菌,35 ℃培养24 h，待测菌株与大肠埃希菌ATCC 25922抑菌圈交汇处大肠埃希菌生长增强即为产碳青霉烯酶阳性菌株。

1.5 E-test法测金属酶 将实验菌悬液调整至0.5麦氏浊度单位,无菌棉签均匀涂抹M-H平板,金属酶E-test条贴M-H平板中央,35 ℃培养18～24 h后观察结果,如亚胺培南/(亚胺培南+EDTA)的MIC比值≥8,判为金属酶阳性。

1.6 改良碳青霉烯类灭活试验(modified carbapenem inactivation method, mCIM)[5]挑取实验菌株1 μL加入2 mL肉汤中,混匀后加入10 μg美罗培南纸片温育4 h,大肠埃希菌ATCC 25922使用生理盐水调0.5麦氏浊度单位涂抹到M-H平板,将肉汤中美罗培南纸片取出,贴于涂抹大肠埃希菌ATCC 25922的M-H平板中间,35 ℃培养18～24 h后观察结果，抑菌圈直径≤15 mm为阳性。

1.7blaNDM-1基因检测 用煮沸法提取细菌DNA,并测纯度和浓度,PCR扩增目标基因。按文献[6]设计引物,引物由大连宝生物公司合成,上游引物:5′-CAGCACACTTCCTATCTC-3′,下游引物:5′-CCGCAACCATCCCCTCTT-3′,产物长度292 bp。PCR反应体系[7]共50 μL,包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL,10×PCR缓冲液5 μL,dNTP混合物4 μL,DNA模板1 μL,Taq酶0.25 μL,加灭菌蒸馏水补足至50 μL。PCR扩增参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延长1 min,共35个循环；72 ℃延长10 min。扩增产物-20 ℃保存备用。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统观察结果并拍照。PCR产物测序送北京擎科新业生物技术公司完成,测序结果在NCBI数据库进行BLAST比对，确认基因型。

2 结果

2.1 药敏试验结果 K-B法药敏结果显示，阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素对65株实验菌株的敏感性为90.1%、56.8%、51.4%、41.6%,其余抗菌药物几乎全部耐药。E-test法检测亚胺培南、美罗培南、厄他培南MIC值与K-B法结果一致,均为碳青霉烯类耐药。

2.2 PCR检测blaNDM-1基因结果 65株碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌blaNDM-1基因特异性引物扩增后，电泳结果显示39株在280 bp处可见明显条带，与阳性对照结果一致，部分PCR产物电泳图见图1。PCR扩增产物后经基因测序证实为blaNDM-1基因序列。

注: M,DNA marker；1～15,试验菌株；16,阳性对照；17,阴性对照。

图1 部分PCR扩增产物电泳结果

2.3 改良Hodge、E-test法测金属酶和mCIM试验结果 65株碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌中有49株改良Hodge试验阳性,阳性率为75.38%(49/65)；46株E-test金属酶试验阳性,阳性率为70.77%(46/65)；63株mCIM试验阳性,阳性率为98.46%(64/65)。39株产blaNDM-1基因阳性菌株中，包括大肠埃希菌7株(17.9%)、肺炎克雷伯菌11株(28.2%)、阴沟肠杆菌14株(35.9%)、弗劳地柠檬酸杆菌5株(12.8%)、产酸克雷伯菌2株(5.1%)。其中，29株改良Hodge试验阳性,阳性率为74.36%(29/39),E-test金属酶试验及mCIM试验阳性率为100%(39/39)。

3 讨论

本研究对临床分离65株碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌进行blaNDM-1基因检测,检测出39株阳性,全部来自三级综合医院,二级医院未发现阳性菌株,阳性率为60%,其余26株blaNDM-1基因阴性菌株耐药机制尚未检测,有待进一步研究。阳性菌株患者信息显示,危重患者、重大术后患者、肾病、血液病等老幼体质较弱患者容易感染,具体机制尚不清楚。

药敏结果显示，65株实验菌株均呈多重耐药,除阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素敏感性为90.1%、56.8%、51.4%、41.6%以外,其余抗菌药物几乎全部耐药,尤其包括亚胺培南、美罗培南在内的β-内酰胺类、氨曲南、复方磺胺甲噁唑和呋喃妥因等药物呈高水平耐药,建议临床轻、中度感染根据药敏结果选择抗菌药物使用,对于重度感染者建议按文献推荐药物进行治疗,如替加环素联合氨基糖苷类、替加环素联合磷霉素、替加环素联合多黏菌素等。但替加环素和多黏菌素临床治疗效果相关的文献较少,建议临床根据治疗效果不断调整治疗方案。

65株实验菌株改良Hodge、E-test金属酶和mCIM试验阳性率分别为75.38%、70.77%、98.46%；39株携带blaNDM-1基因的肠杆菌科细菌改良Hodge、E-test金属酶和mCIM试验阳性率分别为74.36%、100%、100%。改良Hodge和mCIM试验检测碳青霉烯酶,研究结果显示mCIM试验筛选产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌比改良Hodge试验表现出较高的灵敏度,在一定程度上提高了KPC、NDM、OXA型等碳青霉烯酶检出率。而E-test法检测金属酶。没有哪一种表型试验可完全检测出所有碳青霉烯酶,因此建议临床实验室选择mCIM联合E-test金属酶试验检测碳青霉烯酶及其金属酶。

本研究证实甘肃地区肠杆菌科细菌blaNDM-1基因检出率较高，主要在综合性三级医院部分科室局部流行,尤其以重症监护室较为突出,临床及医院感染管理部门应高度重视并采取相应措施,及时做好blaNDM-1基因的检测工作。

[1]Yong D,Toleman MA,Giske CG,etal.Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene，blaNDM-1and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India[J].Antimicrob Agents Chemother,2009，53(12):5046-5054．

[2]叶晓光,苏杞敏.Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1)“超级细菌”的暴发暴露当前抗生素滥用危机[J].中华生物医学工程杂志,2011,17(3):195-198.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing,27th informational supplement(M100-S27)[S].Wayne,PA: CLSI，2017.

[4]刘东汉,刘清泉,石斌,等.中西医结合治疗超级细菌感染1例[J].甘肃医药杂志,2011,24(3):52-54

[5]程阔,于宏伟,马伟立,等.imCIM检测B类碳青霉烯酶的效果评价[J].临床检验杂志,2017，35(1):31-35.

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(本文编辑：周万青，刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.20

甘肃省青年基金(1506RJYA261)。

刘志武，1983年生，男，主管技师，大学本科，从事临床微生物检验工作，E-mail: 375301519@qq.com。

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2017-05-03)