Rabconnectin-3α蛋白在听神经及毛细胞的病理生理学方面的生物学功能

卢嘉文梅玲汪雪玲蔺欣吴皓

1上海交通大学医学院附属第九人民医院耳鼻咽喉-头颈外科

2上海交通大学耳科学研究所

3上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室

·综 述·

Rabconnectin-3α蛋白在听神经及毛细胞的病理生理学方面的生物学功能

卢嘉文1,2,3梅玲1,2,3汪雪玲1,2,3蔺欣1,2,3吴皓1,2,3

1上海交通大学医学院附属第九人民医院耳鼻咽喉-头颈外科

2上海交通大学耳科学研究所

3上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室

Rabconnectin-3（rbc3）蛋白是rab小G蛋白家族中的成员之一，有α和β两个亚基。其中人rbc3α由定位于15号染色体长臂2区1带的dmxl-2（dmx like-2）基因编码，由3036个氨基酸组成，相对分子质量Mr为339,753，包含12个结构域；研究发现，rbc3α表达于啮齿类、灵长类动物的脑组织、内耳，并且在斑马鱼侧线器官亦有表达。随着临床研究的深入，发现rbc3α蛋白除了会导致听力下降以外[1]，还与多种疾病相关。例如dmxl-2突变可影响激素治疗乳腺癌的效果[2]；与芳香化酶过剩综合征[3]也有联系。因此rbc3α的生物学功能成为了近来研究的热点。本文将对近几年关于rbc3α在听神经及毛细胞病理生理学方面的生物学功能的研究进展进行综述。

rabconnectin3α；dmxl-2；突触囊泡；听力下降；生物学功能

【Key words】Rabconnectin3α；Dmxl-2；Synapse Vesicle；Hearing Loss；Biological Function

Thiswork wassupported by grants from the NationalNatural Science Foundation of China(No.81570906),Shanghaiscience and technology comm ission foundation major projects（14DJ1400200）.Shanghai science and technology comm ission foundation（14DZ2260300）.

1 Rbc3α调节Rab3A的活化及失活

神经递质在突触间的传递是生命活动中的关键一环，其过程大致可分为迁移、锚定、激活、融合等几步。Rab3A是rab3家族中的一个成员，在Ca2+依赖的神经递质的转运过程中起到重要的作用[4-6]。主要表现为：1，使迁移和锚定的过程更为便捷[7]；2，阻止Ca2+内流导致的囊泡与膜的融合[8]。Rab3A行使这些生物学功能依赖于其自身的周期性活化与失活。

Rab3A活化是指rab3A-GDP通过rab3激活蛋白（rab3GEP，rab3GDP/GTPexchange protein）激活为rab3A-GTP，而rab3A失活则是指rab3A-GTP由于rab3失活蛋白（rab3 GAP，rab3 GTPase-activing protein）的作用回归到rab3A-GDP的过程。（图1）

图1

Fumiko Nagano等[9]通过免疫共沉淀实验发现在大鼠脑组织中的脑小血管中，rbc3α蛋白可与rab3GEP和rab3GAP结合（图1）。不仅如此，研究还发现在rab3A交替激活和失活的每一轮神经递质释放完后，rbc3α会释放一些诸如“磷酸化”等的调控信息，使得神经递质从胞质区迁移入突触囊泡。这些调控信息对于rbc3α去绑定rab3GEP/GAP是有积极作用的。在rbc3α数量或功能不足的突触囊泡中，神经递质在经历一轮释放后，不能有效的“回收”入囊泡，称之为神经递质循环的“耗竭”或“再充盈不足”，因此会引起听觉传入神经信号传导的异常。另外，rbc3α也作为一个脚手架蛋白（scaf⁃folprotein），对rab3GAP/GEP进行锚定和“抓取”作用，这一现象也是学者们取得的共识，但是具体机制仍然不明。

因此，rbc3α与rab3GEP/GAP的功能密切相关，是保障rab3A的活化失活周期得以顺利进行的条件，是各类细胞（包括内耳毛细胞突触囊泡）中神经递质的胞吐和传导过程中重要的一环。

2 Rbc3α调节V-ATP酶的活性

生理状态下，听觉传入神经递质-谷氨酸借助谷氨酸转运体（vglut3），通过与H+交换进入带状突触囊泡内部。H+在带状突触囊泡空腔内的积聚，即带状突触囊泡的正常酸化是H+与谷氨酸进行转运的必要条件。H+在囊泡内的蓄积依赖V-ATP酶（V-ATPase，Vacuolar-type H+-ATPase）分解ATP将H+泵入囊泡。因此，V-ATP酶是突触囊泡正常酸化的关键催化剂。（图2）

图2

研究发现Rbc3α与V-ATPase全酶之间存在联系。Yan Y等[10]通过免疫共沉淀的方法证明了在果蝇卵巢组织的细胞内rbc3复合物（包括rbc3α和rbc3β）与昆虫V-ATPase胞质区E、H2个亚基有蛋白交互作用，证明了rbc3α与带状突触囊泡中的V-ATPase是具有联系的。

进一步研究发现rbc3α在p3小鼠内耳毛细胞底部呈新月状分布，其分布同vgult3一致，提示正常数量及功能的rbc3α在带状突触囊泡的胞吐转运中发挥作用。换言之，rbc3α数量不足或功能下降将会影响神经递质的正常转运。Zev Einhorn等[11]使用了细胞渗透的pH依赖-染料LysoTracker，用之标记细胞酸化的部分。结果显示：对于野生型的p5小鼠内耳毛细胞中，染料轻易地积聚于带状突触囊泡所在的细胞底部的结果；而在dmxl-2（rbc3α）突变型p5小鼠中，毛细胞底部的荧光信号显著下降（但并不完全消失），且在整个细胞中呈均匀分布，提示毛细胞底部带状突触区域酸化障碍。有数据显示，LysoTracker的信号在pH4~5的环境下最明显，说明rbc3α突变后引起了细胞pH的升高。值得注意的是，在同样的p5野生型小鼠中加入了V-ATPase的特异性抑制剂巴菲霉素（Bafilomycin）1μM后，LysoTracker的荧光信号则几乎检测不到。这也许说明了rbc3α可影响V-ATPase的功能，但是并不是影响V-ATPase的唯一因素。

因此，rbc3α与V-ATPase全酶具有关联，保障了突触囊泡的酸化，使得vglut3转运体能正常转运神经递质（谷氨酸），从而保证内耳毛细胞听觉信号的正常传导。

3 Rbc3α缺乏导致下丘脑-垂体-性腺轴功能紊乱

Juliane Le´ger等[1]在塞内加尔一个近亲婚配的家系中发现，其后代里3个男性青少年表现出了生长发育迟缓、身高体重偏低、渐进性听力下降、轻微智障、外周感觉运动神经脱髓鞘等神经内分泌功能紊乱。抽取3位患者的外周血进行高通量二代测序发现在编码rbc3α的dmxl2基因区有15个核苷酸的缺失。为了证实dmxl2（rbc3α）的突变会导致上述表型，Juliane Le´ger等在定量RT-PCR中发现在c.45824_5838del纯合子患者中DMXL2mRNA的量均有显著减少。强烈提示dmxl2片段缺失、表达量下降会引起生长发育迟缓等临床表现。

Brooke Tata等[1]分别用抗rbc3α抗体和抗促性腺激素抗体对垂体促性腺组织中rbc3α和促FSH、促LH、CRH、TRH等细胞进行复合染色。结果在成年大鼠垂体前叶，只有在促LH与促FSH的细胞中才能观察到rbc3α的免疫染色，这种定位方式类似于Rab3-GAP和Rab3-GEP。而在GHRH、TRH、CRH的细胞中并没有发现与rbc3α的共定位。提示rbc3α在下丘脑和垂体中与促LH细胞、促FSH细胞有关联。

Brooke Tata等[1]设计的能够重现上述病例的表型纯合dmxl2敲除动物模型发现：雌性KO小鼠体重显著低于正常对照组；阴道扩张时间（30天）以及初次性成熟时间（37天）明显晚于同窝的野生型小鼠（28天，29天）；ƒ完整的性周期通常不超过20天，且58%的时间处于发情间期。以上数据均显示出了雌性KO小鼠表现出发育迟缓和生育力低下；而在雄性KO小鼠中，从p25观察到p60，发现其睾丸到肛门的距离明显短于同窝的正常对照小鼠，提示其睾丸发育不良。

dmxl2-KO小鼠性成熟的障碍也导致了其生殖能力的下降。KO小鼠的睾丸和卵巢组织重量分别低于正常对照小鼠13mg和4.4mg(P<0.001)。在雌性ko小鼠的卵巢组织学分析中显示，囊状卵泡的数量正常，而黄体的数量明显低于同窝正常对照组。雌性KO小鼠的雌激素含量正常，而雄性ko小鼠的睾酮含量则显著低于其同窝正常对照小鼠。

通过以上数据可以发现，rbc3α蛋白只表达在促LH与促FSH细胞中，且dmxl2/rbc3α表达量的下降在人类以及实验动物（C57BL6小鼠）均会引起青春期的发育功能不良、发育时间延迟和下丘脑-垂体-性腺轴的紊乱等。

4 Rbc3α对Wnt信号通路的调控

细胞的迁移与人体内各种活动都息息相关。细胞的迁移依赖于细胞-细胞间粘附和信号传递的动态调控。脊椎动物的神经嵴细胞(neural crest cell，NCC)通过上皮间质转化(epithelial-mesenchy⁃mal transition,EMT)，即上皮细胞在形态学上发生向间质细胞表型的转变，获得高度迁移的能力。EMT是恶性肿瘤转移的标志[12]，也是胚胎早期发育、器官生成以及伤口愈合中的一个重要过程[13]。经典Wnt信号通路（CanonicalWnt Signaling）作为诱导上皮组织EMT产生的关键信号转导通路是国内外学者的共识[14]。经典Wnt通路（CanonicalWnt Sig⁃naling／β-catenin通路）主要通过核内β链接蛋白（β-catenin）的累积，激活Wnt相关靶基因引起后续改变。因此，核内β链接蛋白正常的活化可以促进胚胎早期发育（包括内耳毛细胞的发育[15]），而核内β链接蛋白活化过度或者失调可引起肿瘤的形成。

有文献报道，在NC细胞迁移的过程中，rbc3α也参与了Wnt信号通路的调控[16]。正常情况下，NC细胞膜表面大部分β-链接蛋白（β-catenin）与E钙黏附蛋白（E-cadherin）和细胞骨架蛋白（actin）结合形成稳定的复合物，胞质内少量的游离β-链接蛋白不能进入核内激活靶点。而在Wnt信号存在时，人低密度脂蛋白受体相关蛋白6（Low-density lipo⁃protein receptor-related protein 6，LRP6）会被磷酸化。只有当LRP6磷酸后，β-链接蛋白才能够与Wnt蛋白、跨膜受体-7蛋白（Frizzled-7）形成新的复合物，这可使得β-链接蛋白进入细胞质，并在胞质内水平得到累积后转位进入细胞核，调节靶基因的表达[17]。因此，经典Wnt通路需要细胞质内V-ATPase介导的酸化，这是使LRP6磷酸化的必要条件[18]（图3）。

图3

前已述及，rbc3α具有维持细胞pH值的功能。Adam M.Tuttle等[15]在果蝇中的研究发现低pH值有助于细胞内LRP6的磷酸化，从而使原β-链接蛋白复合物解离，并形成新的复合物促进Wnt通路下游的信号。而在rbc3α缺乏的核内体、溶酶体中Wnt信号通路则受到抑制，并表现出迁移速度和迁移持续性的降低。并且，rbc3α对于frizzle-7在NC细胞膜表面上的固定也有作用。缺乏rbc3α的NC细胞没有足够的frizzle-7用以和β-链接蛋白形成复合物进入细胞质。Shi Fuxing[19]等发现，在敲除β-链接蛋白（即经典Wnt通路无效）的模型中，内耳毛细胞与柱状细胞的发育再生均受到影响。这与我们之前讨论的经典Wnt通路促进胚胎早期发育的观点是一致的。

另一方面，钙粘素（cadherin）作为细胞-细胞间粘附分子的调控者之一，具有介导细胞连接和抑制细胞迁移的功能。在缺乏rbc3α或者V-ATPase功能不全的斑马鱼胚胎中发现，钙粘素的表达发生了上调紊乱，同样致使了NC细胞EMT和迁移的失败，影响了听觉上皮细胞的正常作用[16]。

小结以上，rbc3α在Wnt信号通路中有以下作用：1，促进核内体溶酶体的成熟酸化，使LRP6磷酸化后正常激活Wnt信号通路的下游信号，保障内耳毛细胞的发育；2，固定NC膜表面的frizzle-7;3，正常表达钙粘素，让听觉上皮细胞能够正常发挥作用。而V-ATPase及其相关蛋白（rbc3α）的异常会引起Wnt信号通路的异常，从而妨碍毛细胞的发育和听觉上皮细胞功能。

5 总结

综上所述，rbc3α蛋白是神经递质的转运和信号传导过程中重要的一环；在人的听觉系统方面，是产生正常的听觉电信号的必要条件；在内分泌及生长发育方面，rbc3α的缺乏会导致生长缓慢、不孕不育等不良后果；在Wnt信号通路传导方面，是让内毛细胞正常发育的重要因素。因此，rbc3α蛋白的功能失调可以导致耳聋、生长发育迟缓、糖尿病等家族遗传性特征的临床表现，其危害不容忽视。不过随着人类基因组计划的完成，我们已经进入功能基因组学时代，分析特定基因的功能已经成为明确致病机制的关键，并且有助于进一步制定基因治疗的策略。然而，仍然有一些问题，譬如关于rbc3α作为脚手架蛋白（scaffol protein）去抓取rab3GEP/ GAP的机制等等，目前仍旧不清，有待于科学家们进一步的探索和阐释。

1 Brooke Tata,Lukas Huijbregts,Nicolas de Roux et,al.Haploinsuffi⁃ciency of Dmxl2,Encoding a Synaptic Protein,Causes Infertility Associated with a Loss of GnRH Neurons in Mouse.PLoS Biol, 2014,12(9)

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Biological Functionsof Rabconnectin-3αin Pathophysiology Involving Hair Cellsand Auditory Nerve

LU Jiawen1,2,3,MEILing1,2,3,WANGXueling1,2,3,LINXin1,2,3,WUHao1,2,3
1DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,ShanghaiNinth People’sHospitalaffiliated to Shanghai Jiaotong University SchoolofMedicine
2Shanghai Jiaotong University Ear institute,
3ShanghaiKey Laboratory of TranslationalMedicine in Earand NoseDiseases, 200029,Shanghai,China

WUHao Email:wuhao622@sina.com

Rabconnectin-3(rbc3)protein is amember of the rab small GTP-binding protein fam ily,and contains two subunits calledαandβ.Human rbc3αis encoded by the dmxl-2(dmx like-2)genewhich is located on chromosome 15 q2.1,consists of 3,036 am ino acids,shows a calculated M r of 339,753 and contains 12WD domains.Research has found that rbc3αexpresses in both the brain and inner ear of rodentand primate animals,aswellas in the lateral line organ of zebra fish.As relevant research continues,rbc3αis found notonly to be involved in hearing loss,butalso related w ith various diseases.For example,dmxl-2mutation can affect the outcomes of hormonal therapy resistantbreast cancer.Besides,suchmutations are related w ith aromatase excess syndrome.Therefore,the biological function of rabconnectin-3αhas become a hot topic of recent research.The present review summarizes research progresson the biological functionsof rbc3αin relation to pathophysiology involving hair cellsand auditory nerve in recentyears.

R764

A

1672-2922（2017）03-345-5

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.03.014

国家自然科学基金（81570906）；上海市科委基础重大项目（14DJ1400200）；本项研究工作得到了上海市科学技术委员会的课题支持，编号为14DZ2260300

卢嘉文，硕士在读，研究方向:耳科学

吴皓，Email:wuhao622@sina.com

*There isno conflictof interest in this review.