甘草根和根茎的化学成分研究

张 杰，李鸿钰，徐丽丽，曾 铖，李 佑，顾大全，顾正兵△

（1.江苏永健医药科技有限公司，江苏 泰州 225300； 2.湖南省宁乡县人民医院，湖南 长沙 410600）

·实验研究·

甘草根和根茎的化学成分研究

张 杰1，李鸿钰2，徐丽丽1，曾 铖1，李 佑1，顾大全1，顾正兵1△

（1.江苏永健医药科技有限公司，江苏 泰州 225300； 2.湖南省宁乡县人民医院，湖南 长沙 410600）

目的 研究甘草根和根茎的化学成分。方法 采用硅胶柱层析，制备高效液相色谱和重结晶等手段分离纯化，根据理化性质和波谱数据进行结构鉴定，并利用高效液相色谱－二极管阵列检测器（HPLC－DAD）法首次测定甘草中对羟基苄基丙二酸和柚皮素－7－O－葡萄糖苷的含量。结果 分离并鉴定了11个化合物，包括对羟基苄基丙二酸、甘草苷、新甘草苷、异甘草苷、新异甘草苷、柚皮素－7－O－葡萄糖苷、芒柄花苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草素和异甘草素；其中，对羟基苄基丙二酸为国内首次从甘草中分离得到，柚皮素－7－O－葡萄糖苷为首次从甘草中分离得到，其进样量分别在0.129～1.29μg和0.016～0.16μg范围内与色谱峰峰面积线性关系良好；平均加样回收率分别为98.47%和99.08%，RSD分别为1.71%和1.74%（n＝6）。结论 该含量测定方法简单准确，能为甘草的研究提供新的参考。

甘草；化学成分；高效液相色谱－二极管阵列检测法；对羟基苄基丙二酸；柚皮素－7－O－葡萄糖苷

甘草为豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.，胀果甘草 Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草 Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药之功效，可用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性[1]。本试验中对甘草化学成分进行了研究，从甘草甲醇提取物的正丁醇部位分离并鉴定了11个化合物，其中的对羟基苄基丙二酸为国内首次从甘草中分离得到[2]，柚皮素－7－O－葡萄糖苷为首次从甘草中分离得到，且首次对甘草中的这2个成分进行了含量测定，可为甘草的深入研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Varian INOVA－400型核磁共振仪（TMS为内标，美国Varian公司）；四极杆－飞行时间串联（Q－TOF）质谱仪（德国Bruker公司）；Waters Delta Prep 4000 VWD型高效液相色谱仪（制备型，美国Waters公司）。

1.2 试药

羟丙基葡聚糖凝胶（SephadexLH－20，美国GE公司）；薄层色谱及柱色谱用硅胶（青岛海洋化工有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；甘草来源于安徽亳州药材市场，经嘉兴学院医学院王峻副教授鉴定为豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎；对羟基苄基丙二酸和柚皮素－7－O－葡萄糖苷对照品为江苏永健医药科技有限公司自制，质量分数均大于98%。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

取干燥的甘草药材10 kg，粉碎，过3号筛，用70%甲醇回流提取3次（每次10倍量，提取2 h），合并提取液，减压浓缩至2.0 L左右，加温水2.5 L混悬，依次用石油醚－乙酸乙酯（1∶1）、正丁醇萃取3次，合并相同溶剂萃取液并减压浓缩，得石油醚－乙酸乙酯（1∶1）萃取物95.7 g、正丁醇萃取物843.5 g。

取正丁醇萃取物经反复硅胶柱层析，依次用乙酸乙酯－甲醇系统、乙酸乙酯－甲醇－水系统不同比例洗脱，得11个流分。其中，流分2经SephadexLH－20及重结晶方法得到化合物10（308.1mg）、化合物11（529.4mg）；流分 5经 SephadexLH－20、制备液相及重结晶手段分离纯化得到化合物2（7.32 g）、化合物4（3.57 g）、化合物 5（108.7 mg）、化合物 6（225.1 mg）、化合物 7 （412.5mg）；流分7经重结晶和制备液相得到化合物1 （203.6 mg）、化合物3（418.7 mg）；流分9经硅胶柱色谱，乙酸乙酯－甲醇－水梯度洗脱，制备液相得到化合物8（195.6mg）和化合物9（174.9mg）。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）－0.1%磷酸（B），梯度洗脱，0～10min时15%～20%A，10～20min时20%～22%A，20～25min 时22% ～25%A；流速：1.0m L／min；柱温：35℃；检测波长：220 nm。在此色谱条件下的色谱图见图1。

2.2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取对羟基苄基丙二酸和柚皮素－7－O－葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成含对羟基苄基丙二酸258.72μg／m L和柚皮素－7－O－葡萄糖苷32.00μg／mL的混合对照品溶液。

供试品溶液：称取甘草药材约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定质量，超声30 min，放至室温，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取上述混合对照品溶液0.50，1.25，2.50，3.75，5.00m L，分别置不同的10m L容量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取5种溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定。以进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，对羟基苄基丙二酸为 Y＝2×106X－49 610，r＝0.999 9（n＝5），进样量线性范围为0.129～1.29μg；柚皮素－7－O－葡萄糖苷为 Y＝4×106X＋40 051，r＝0.999 9（n＝5），进样量线性范围为0.016～0.16μg。

B1.对羟基苄基丙二酸 2.柚皮素－7－O－葡萄糖苷A.混合对照品溶液 B.供试品溶液图1 高效液相色谱图

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液10μL，按拟订色谱条件连续进样6次。结果对羟基苄基丙二酸和柚皮素 －7－O－葡萄糖苷峰面积的 RSD分别为0.70%和0.96%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，室温放置，分别于0，2，4，6，8，10，12h时进样，测定。结果对羟基苄基丙二酸和柚皮素－7－O－葡萄糖苷峰面积的 RSD分别为0.87%和0.91%（n＝7），表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

重复性试验：取6份2号样品粉末，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样，测定对羟基苄基丙二酸和柚皮素－7－O－葡萄糖苷的含量。结果的 RSD分别为1.14%和1.33%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：称取已测定的2号样品粉末6份，每份约0.25 g，精密称定，加入2.2.2项下混合对照品溶液5.80mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样，测定。结果见表1。

表1 甘草药材中2种成分加样回收试验结果（n＝6）

2.2.4 样品含量测定

取不同来源甘草药材粉末约0.5 g，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算样品中对羟基苄基丙二酸和柚皮素－7－O－葡萄糖苷的质量分数。结果见表2。

表2 甘草药材中2种成分含量的测定结果(%)

2.3 结构鉴定

2.3.1 化合物1

黄色粉末。ESI－MS（m／z）：233.02[M＋Na]＋，209.05[M－H]－，提示相对分子质量为 210；165.07 [M－COOH]－，121.07[M－2COOH]－，提示分子中含有2个羧基。结合1H－NMR和13C－NMR谱确定分子式为C10H10O5。

1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：2.93（2H，d，J＝7.6Hz），3.46（1H，t，J＝7.6Hz），6.66（2H，d，J＝8.0Hz），7.00（2H，d，J＝8.0 Hz），9.20（1H，brs）。

13C－NMR（100MHz，DMSO－d6）δ：170.31（C－1，4），53.82（C－2），33.52（C－3），128.67（C－1′），129.64 （C－2′，6′），115.11（C－3′，5′），155.83（C－4′）。

以上数据与文献[2]报道的对羟基苄基丙二酸数据基本一致，故鉴定化合物1为对羟基苄基丙二酸。

2.3.2 化合物2

白色粉末。ESI－MS（m／z）：441.07[M＋Na]＋，417.13[M－H]－，相对分子质量为418，结合1H－NMR 和13C－NMR谱确定分子式为C21H22O9。

1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.64（1H，d，J＝8.8 Hz），7.43（2H，d，J＝8.4 Hz），7.06（2H，d，J＝8.8 Hz），6.51（1H，dd，J＝8.8，2.4 Hz），6.35（1H，d，J＝2.4 Hz）。

以上数据与文献[3]报道的甘草苷数据基本一致，且化合物2与甘草苷标准品薄层色谱（TLC）对照，比移（Rf）值相同，综合上述数据，鉴定化合物2为甘草苷。

2.3.3 化合物3

黄色粉末。ESI－MS（m／z）：441.07[M＋Na]＋，417.13[M－H]－，相对分子质量为418，结合1H－NMR 和13C－NMR谱，确定分子式为C21H22O9。

1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：5.49（1H，dd，J＝12.8，3.2 Hz），7.72（1H，d，J＝8.8 Hz），6.73（1H，d，J＝8.8 Hz），6.65（1H，d，J＝1.2 Hz），7.33（2H，d，J＝8.4 Hz），6.80（2H，d，J＝8.4 Hz），4.98（1H，d，J＝7.2 Hz，1′′－H ofGlu）。

13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）δ：79.30（C－2），43.24（C－3），190.51（C－4），129.22（C－5），111.03 （C－6），163.59（C－7），103.72（C－8），162.98（C－9），113.56（C－10），128.37（C－2′，6′），115.39（C－3′，5′），99.96（C－1′′of Glu），73.24（C－2′′of Glu），76.56 （C－3′′of Glu），69.76（C－4′′of Glu），77.19（C－5′′of Glu），60.79（C－6′′ofGlu）。

以上数据与文献[4]报道的新甘草苷数据基本一致，故鉴定化合物3为新甘草苷。

2.3.4 化合物4

黄色粉末。ESI－MS（m／z）：441.07[M＋Na]＋，417.13[M－H]－，相对分子质量为418，结合1H－NMR 和13C－NMR谱，确定分子式为C21H22O9。

1H－NMR（400MHz，DMSO－d6）δ：7.44（2H，d，J＝8.8 Hz），7.06（2H，d，J＝8.8 Hz），7.83（2H，d，J＝15.6 Hz），7.76（2H，d，J＝15.6 Hz），8.15（1H，d，J＝8.8 Hz），6.51（1H，dd，J＝8.8，2.0 Hz），6.35（1H，d，J＝2.0 Hz）。

13C－NMR（100MHz，DMSO－d6）δ：60.90（C－6′′），69.85（C－4′′），73.41（C－2′′），76.80（C－5′′），77.29 （C－3′′），100.24（C－1′′），102.83（C－3），108.53（C－5），113.08（C－1′），116.72（C－3，5），119.41（C－a），125.82（C－1），128.59（C－2，6），130.79（C－6′），143.50（C－β），159.56（C－4），165.62（C－2′），165.98 （C－4′），191.54（C＝O）。

以上数据与文献[4－5]报道的异甘草苷数据基本一致，故鉴定化合物4为异甘草苷。

2.3.5 化合物5

黄色粉末。ESI－MS（m／z）：441.07[M＋Na]＋，417.13[M－H]－，相对分子质量为418，结合1H－NMR 和13C－NMR谱确定分子式为C21H22O9。

1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：13.41（1H，s，OH），10.07（1H，s，OH），8.24（1H，d，J＝8.8 Hz），6.85 （1H，d，J＝8.4 Hz）。

13C－NMR（100MHz，DMSO－d6）δ：60.82（C－6′′），69.83（C－4′′），73.28（C－2′′），76.62（C－5′′），77.32 （C－3′′），99.85（C－1′′），103.69（C－3），108.34（C－5），115.01（C－1′），116.01（C－3，5），117.59（C－a），125.82（C－1），131.42（C－2，6），132.48（C－6′），145.05（C－β），160.53（C－4），163.65（C－2′），165.16 （C－4′），192.20（C＝O）。

以上数据与文献[6]报道的新异甘草苷数据基本一致，故鉴定化合物5为新异甘草苷。

2.3.6 化合物6

浅黄色针晶（甲醇）。ESI－MS（m／z）：457.06[M＋Na]＋，433.11[M－H]－，相对分子质量为 434；271.08 [M－Glc－H]－，提示结构中含有葡萄糖基。结合1HNMR和13C－NMR谱，确定分子式为C21H22O10。

1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：12.10（1H，s，4′－OH），7.43（2H，d，J＝8.8 Hz，H－2′，6′），7.07（2H，d，J＝8.4 Hz，3′，5′），5.51（1 H，dd，J＝12.4，2.8 Hz，H－2），4.88（1H，d，J＝7.2 Hz，H－1′′）。

13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）δ：196.14（C－4），166.79（C－7），163.59（C－5），162.89（C－9），157.69 （C－4′），132.07（C－1′），128.08（C－2′，6′），116.42 （C－3′，5′），103.3（C－10），100.57（C－1′′），96.01 （C－6），95.15（C－8），78.20（C－2），77.17（C－3′′），76.78（C－5′′），73.37（C－2′′），69.94（C－4′′），60.90 （C－6′′），42.12（C－3）。

以上数据与文献[7－9]报道的柚皮素－7－O－葡萄糖苷数据基本一致，故鉴定化合物6为柚皮素－7－O－葡萄糖苷。

2.3.7 化合物7

白色粉末状结晶。1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：8.39（1H，s），8.06（1H，d，J＝9.2 Hz），7.53（2H，d，J＝8.4 Hz），6.98（2H，d，J＝8.4 Hz），3.78（3H，s）。

13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）δ：174.69（C－4），161.59（C－7），159.19（C－4′），157.15（C－9），130.63 （C－6′），127.08（C－5），124.15（C－3），123.55（C－1′），118.65（C－10），115.75（C－6），113.79（C－5′），100.28（1－C of Glu），77.36（5－C of Glu），76.65（3－C of Glu），73.32（2－C of Glu），69.88（4－C of Glu），60.87 （6－C of Glu）。

以上数据与文献[10－11]报道的芒柄花苷数据基本一致，故鉴定化合物7为芒柄花苷。

2.3.8 化合物8

白色粉末。1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：1HNMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.65（1H，d，J＝8.8 Hz），7.44（2H，d，J＝8.4 Hz），7.05（2H，d，J＝8.8 Hz），6.51 （1H，dd，J＝8.8，2.4 Hz），6.35（1H，d，J＝2.4 Hz），5.30（1H，d，J＝3.2 Hz）5.06（1H，d，J＝7.5 Hz）。

13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）δ：190.08（C－4），164.87（C－7），163.25（C－9），157.55（C－4′），132.65 （C－1′），128.63（C－2′，6′），116.36（C－3′，5′），110.82 （C－10），108.98（C－1′′′′），102.85（C－8），99.04（C－1′′），79.47（C－2）。

以上数据与文献[4]报道的芹糖甘草苷数据基本一致，故鉴定化合物8为芹糖甘草苷。

2.3.9 化合物9

黄色结晶。1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.84 （2H，d，J＝8.8 Hz），7.09（2H，d，J＝8.8 Hz），7.83（2H，d，J＝15.2 Hz），7.76（2H，d，J＝15.2 Hz），8.14（1H，d，J＝8.8 Hz），6.51（1H，dd，J＝8.8，2.0 Hz），6.35（1H，d，J＝2.0 Hz）。

13C－NMR（100MHz，DMSO－d6）δ：60.80（C－6′′），70.15（C－4′′），74.11（C－2′′），76.15（C－5′′），77.12 （C－3′′），102.82（C－3），108.91（C－1′′′′），98.66（C－1′′），108.68（C－5），113.08（C－1′），116.59（C－3，5），119.51（C－a）， 125.82（C－1）， 128.65（C－2， 6），130.78（C－6′），143.31（C－β），159.38（C－4），165.62 （C－2′），165.98（C－4′），191.37（C＝O）。

以上数据与文献[12]报道的芹糖异甘草苷数据基本一致，故鉴定化合物9为芹糖异甘草苷。

2.3.10 化合物10

白色粉末。1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.64 （1H，d，J＝8.8 Hz），7.31（2H，d，J＝8.4 Hz），6.77（2H，d，J＝8.8 Hz），6.49（1H，dd，J＝8.8，2.4 Hz），6.33 （1H，d，J＝2.4 Hz）。

以上数据与文献[3]报道的甘草素数据基本一致，且化合物10与甘草素标准品TLC对照，Rf值相同，综合上述数据，鉴定化合物10为甘草素。

2.3.11 化合物11

黄色晶体。1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.44 （2H，d，J＝8.8Hz），7.06（2H，d，J＝8.8 Hz），7.83（2H，d，J＝15.6 Hz），7.76（2H，d，J＝15.6 Hz），8.15（1H，d，J＝8.8 Hz），6.51（1H，dd，J＝8.8，2.0 Hz），6.35（1H，d，J＝2.0 Hz）。

以上数据与文献[3]报道的异甘草素数据基本一致，且化合物11与异甘草素标准品TLC对照，Rf值相同，综合上述数据，鉴定化合物11为异甘草素。

3 讨论

3.1 提取条件确定

比较了超声提取和回流提取2种提取方式，提取溶剂考察了甲醇和乙醇，以对羟基苄基丙二酸和柚皮素－7－O－葡萄糖苷为指标，经综合比较，最终确定提取条件为加70%乙醇，提取1次，超声30min。

3.2 检测波长选择

利用DAD检测器，观察到220 nm为对羟基苄基丙二酸的最大吸收波长，同时柚皮素－7－O－葡萄糖苷有较强吸收，并综合考虑基线、干扰峰等最终确定220 nm为检测波长。

3.3 研究价值

甘草作为传统的常用中药材，国内外对其成分研究报道较多，本研究中从甘草中分离得到了11个化合物，其中对羟基苄基丙二酸为在国内首次从甘草中分离得到，柚皮素－7－O－葡萄糖苷为首次从甘草中分离得到，并首次对甘草中的这2种成分进行了含量测定，7个样品中均含有这2种成分，其中对羟基苄基丙二酸在各样品中的含量相对较高，柚皮素－7－O－葡萄糖苷含量较低；宁夏盐池产样品2种成分含量均最高，新疆喀什巴楚产样品2种成分含量均最低，提示成分间可能有一定相关性。另一方面，直到 2014年，国外学者Simmler等[2]才首次从甘草中分离出对羟基苄基丙二酸。甘草在我国虽被誉为“国老”，但之前无国内研究分离得到此2种成分的报道，本研究中首次同时测定对羟基苄基丙二酸和柚皮素－7－O－葡萄糖苷的含量，为甘草的深入研究及相关药效物质基础提供了重要启示和新的方向。此结果对于传统药材甘草的药理药效研究有重要指导意义，并可为阐释甘草的相关活性提供重要参考。

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Chem ical Constituents of the Root and Rhizom e of Glycyrrhiza Uralensis Fisch.

Zhang Jie1，Li Hongyu2，Xu Lili1，Zeng Cheng1，Li You1，Gu Daquan1，Gu Zhengbing1
（1.Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Technology CO.，LTD.，Taizhou，Jiangsu，China 225300； 2.Ningxiang People′s Hospital，Changsha，Hunan，China 410600）

Ob jective To study the chemical constituents in the root and rhizome of Glycyrrhiza Uralensis Fisch..M ethods Silica gel column chromatography was adopted，HPLC and recrystallization were used to isolate and purify，and the structures were identified by physical and chemical properties and spectral data.P－hydroxybenzylmalonic acid and naringenin－7－O－β－D－glucoside in Glycyrrhiza Uralensis Fisch.were determined by HPLC－DAD method for the first time.Results Eleven compouds were isolated and characterized as P－hydroxybenzylmalonic acid，liquiritin，neoliquiritin，isoliquiritin，neoisoliquiritin，naringenin－7－O－β－D－glucoside，ononin，liquiritinapioside，isoliquiritin apioside，glycyrrhizin，isoliquiritigenin.P－hydroxybenzylmalonic acid was isolated from Glycyrrhiza Uralensis Fisch.for the first time in domestic，and naringenin－7－O－β－D－glucoside was isolated from Glycyrrhiza Uralensis Fisch.for the first time.P－hydroxybenzylmalonic acid and naringenin－7－O－β－D－glucoside had good linearity in the ranges of 0.129－1.29 μg，0.016－0.16 μg，respectively.The average recoveries of the two constituents were 98.47%，99.08% ，respectively.The RSDs were 1.71%，1.74%，respectively.Conclusion The method is simple and accurate，which can provide new reference for studying Glycyrrhiza Uralensis Fisch.

Glycyrrhiza Uralensis Fisch.；chemical constituents；HPLC－DAD；P－hydroxybenzylmalonic acid；naringenin－7－O－β－D－glucoside

R284；R282.71

：A

：1006－4931(2017)12－0015－05

2017－02－15)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.12.004

张杰，男，硕士研究生，研究方向为中药分析和天然药物化学，（电子信箱）13478536926＠163.com。

△通讯作者：顾正兵，男，博士研究生，研究方向为天然药物化学，（电话）0523－86183626。