山楂酸对顺铂肾毒性的影响研究*

欧阳资章，朱少华，邬淑红，刘晓萍，常惠礼，麦露丝，肖诚胤

（1.广州医科大学附属第六医院，广东 清远 511515； 2.中山大学药学院，广东 广州 510006；3.广东省清远市妇幼保健院，广东 清远 511500）

·实验研究·

山楂酸对顺铂肾毒性的影响研究*

欧阳资章1，朱少华2，邬淑红3，刘晓萍1，常惠礼1，麦露丝1，肖诚胤1

（1.广州医科大学附属第六医院，广东 清远 511515； 2.中山大学药学院，广东 广州 510006；3.广东省清远市妇幼保健院，广东 清远 511500）

目的 探讨山楂酸对顺铂诱导肾损伤的影响。方法 选用人肾小管上皮HK－2细胞，试验共分4组，即对照组、顺铂组、山楂酸保护组(山楂酸＋顺铂)、维生素E保护组(维生素E＋顺铂)。应用MTT法检测各组细胞活性，检测乳酸脱氢酶（LDH）浓度以判断肾细胞损伤情况，Hochest33342／PI染色法测定细胞凋亡情况。结果 加入顺铂24 h后，HK－2细胞存活率明显下降，LDH释放增加，并观察到细胞凋亡；而预先给予山楂酸以及维生素E，细胞存活率明显增加，LDH释放减少，细胞凋亡减少。结论 在HK－2细胞试验中，山楂酸对顺铂所致细胞毒性有防护作用。

山楂酸；顺铂；肾损伤；乳酸脱氢酶

顺铂为广泛应用的铂类抗肿瘤药物，在许多肿瘤的治疗中疗效显著。作为细胞毒性药物，肾毒性为其主要不良反应，不仅影响顺铂的用药剂量及化学治疗（简称化疗）进程，且严重影响患者的生活质量，在很大程度上限制了顺铂的临床应用。临床虽可采取水化方法或使用渗透性利尿药以减少肾毒性，但顺铂所致肾毒性的发生率仍高达30%以上[1]。山楂酸为五环三萜酸，存在于山楂、红枣等多种植物中，近年来研究发现，其具有多种药理活性，如抗癌[2]、抗氧化[3－4]、抗艾滋病[5]、抗菌[6]、抗2型糖尿病[7]、舒张动脉血管[8]等作用。在前期研究中，笔者发现山楂酸具有抗氧化作用，且对顺铂所致大鼠肾毒性具有防护作用[8]，为此，笔者以人肾小管上皮细胞为研究对象，研究山楂酸是否对顺铂所致肾小管上皮细胞毒性有防护作用，旨在为山楂酸的临床应用提供科学依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试药、细胞及仪器

试药及细胞：山楂酸（长沙雅莹生物科技有限公司，批号为20130712）；顺铂（南京建成生物工程研究所，批号为20130327）；维生素E（中国食品药品检定研究院，批号为20130209）。人近段肾小管上皮HK－2细胞（中山大学动物实验中心细胞库提供，2012年引进）；MTT试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号为20130518）；LDH试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号为20130623）；DMEM干粉培养基（美国Invitrogen公司，批号为1272041）。

仪器：TGLL－18G型台式低温高速冷冻离心机（太仓市医疗器械厂）；SW－CJ－2FD型超净工作台（苏州净化设备有限公司）；755S型紫外分光光度计（上海第三分析仪器厂）；BS223S型电子天平（北京赛多利斯仪器系列有限公司）；WJ－3－80型CO2培养箱（上海市跃进医疗器械厂）；318C＋型多功能酶标仪（上海沛欧分析仪器有限公司）；TE2000－U型荧光显微镜（日本株式会社尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 MTT试验

取对数生长期细胞，用含10%胎牛血清DMEM培养液配成单个细胞悬液，调细胞密度至2.5×104个／m L，以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积为200μL，将培养板放入CO2孵箱，在37℃及5%CO2条件下，培养24 h，吸弃培养液，每孔加入180μL培养基，将配制好的顺铂贮备液加入无血清培养基中，无菌过滤，加入相应板相应孔中，终液200μL，孵育24 h。试验分为对照组、顺铂组、山楂酸保护组、维生素E保护组。对照组不加任何药物，顺铂组药物终质量浓度为100mg／L，山楂酸保护组、维生素E保护组需预先分别给予无菌过滤的山楂酸（终质量浓度为40mg／L）及维生素E（终质量浓度为100 mg／L）0.5 h后再给予顺铂（终质量浓度为100mg／L），24 h后，吸弃培养液，每孔各加180μL无血清高糖DMEM培养液和MTT溶液（5mg／L）20μL，37℃继续孵育4 h。孵育结束后小心吸弃孔内培养上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤1次，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO），室温振荡10 min，使甲 充分溶解，选择570 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度，记录结果，并计算其生存率。

1.2.2 乳酸脱氢酶（LDH）活性测定

细胞上清液中LDH含量可反映细胞发生晚期凋亡及坏死的程度。试验分组及药物终质量浓度同MTT试验。取对数生长期的HK－2细胞，以2×105个／孔的密度接种于24孔板，培养24 h后更换无血清培养基使之同步化。12 h后弃去无血清培养基，换成含血清1%的培养基，加入已用无血清的稀释并过滤的顺铂，继续培养，24 h后收集细胞上清，液测定细胞LDH活性。或在加入顺铂前，预先给予山楂酸或者维生素E，于相应时间点收集细胞培养上清液，测定LDH活性。

1.2.3 Hoechst33342／PI染色法测定细胞凋亡和坏死

试验分组及药物终质量浓度同MTT试验。取对数生长期的细胞消化，接种于6孔板，每孔接种细胞数量为8×105个，体积为2 mL，24 h后弃去培养基，换无血清培养基培养。12 h后弃去无血清培养基，换成无血清的培养基，加入已用无血清的稀释并过滤的顺铂，继续培养。24 h后，弃去培养基，用预冷PBS洗涤细胞2次，加入Hoechst33342以及PI，37℃染色5～10 min。染色后弃去染色液，用PBS轻轻洗涤细胞2次，在荧光显微镜下观察，照相保留结果。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件分析。除形态学结果外，其他数据以均数±标准差（±s）表示，行 t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 山楂酸对顺铂诱导HK－2细胞存活率的影响

结果见表1。对照组细胞活力未改变，顺铂组细胞存活率与对照组相比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；而预先给予山楂酸或维生素E，均能增加细胞活力，与顺铂组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 山楂酸对顺铂诱导HK－2细胞存活率的影响

2.2 LDH漏出量检测结果

结果见表2。顺铂刺激细胞后，上清液中LDH含量明显增加，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；预先给予山楂酸或维生素E能减少上清液中LDH含量，与顺铂组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组LDH漏出情况

2.3 细胞凋亡和坏死结果

结果见图1。对照组未见凋亡细胞、坏死细胞或晚期凋亡小体，顺铂组可见凋亡小体（亮蓝色，即图中亮色箭头所指处）及晚期凋亡小体（红色，核断裂，即图中暗色箭头所指处）。预先给予山楂酸或维生素E，凋亡细胞及坏死细胞均减少。

3 讨论

顺铂是目前临床常用的重要的金属铂类化疗药物，其疗效肯定，作用强度随剂量增加而增大。顺铂在体内主要经肾脏排泄，金属铂离子可蓄积在肾脏，故其肾毒性最明显。顺铂对肾脏的不同部位均有毒性，可引起肾小球、肾小管功能及形态学改变。其主要损伤肾小管，特别是近曲小管和集合管，使上皮细胞水肿变性，基底增厚，肾间质轻度纤维化，可诱导肾小管上皮细胞发生凋亡、坏死[7，9－10]。

A.对照组 B.顺铂组 C.山楂酸保护组D.维生素E保护组图1 Hoechast33342／PI染色法测定细胞凋亡和坏死

目前，临床主要采取水化方法减轻顺铂的细胞毒性[11]。一直以来，尽管缺乏明确的证据，许多医疗机构仍将水化＋甘露醇作为常规预防措施，以加快顺铂从体内消除，减少毒副反应。但大量水化对心、肾功能不全，胸、腹腔积液及糖尿病患者不适用，而解毒剂等仅适用于双路疗法的患者，且有可能降低疗效。近年来，一些天然活性物质因独特的作用机制显示了对肿瘤化疗的增效作用，且对机体无毒[12－14]，但在动物实验或实际应用中并未获得良好的疗效。

Montilla等[14]发现，山楂酸能抑制由氧自由基引起的肝细胞膜中的脂质过氧化，可能抵抗生物体内的氧化应激作用，避免细胞受到损伤。顺铂的肾毒性可能与氧化应激及其金属铂离子在肾脏蓄积有关。山楂酸为新型糖原磷酸化酶抑制剂，能抑制糖酵解，进而产生抗氧化作用。

前期研究结果显示，山楂酸对顺铂的肾毒性确实具有防护作用[8]。因此，本研究中采用人近段肾小管上皮细胞为模型细胞，研究山楂酸是否对顺铂所致人肾小管上皮细胞毒性同样具有防护作用[15]。本研究中选择HK－2细胞作为体外观察顺铂肾毒性的细胞模型，MTT试验结果表明，顺铂能降低细胞活力，而山楂酸则能增加细胞活力。LDH是存在于细胞质中的蛋白酶，当细胞膜完整时，其并不能溢出至细胞外。一旦细胞膜被破坏，细胞发生坏死时，LDH则释放至细胞外。不过，体外培养细胞在晚期凋亡时，如凋亡小体得不到及时清除，凋亡小体的膜通透性会增加，LDH也会释放至培养液中。本研究中给予顺铂后，LDH释放明显增加，而预先给予山楂酸则能减少顺铂所致的LDH释放，进一步印证了山楂酸对肾细胞的保护作用。Hoechst33342／PI染色试验表明，顺铂能诱导细胞凋亡及坏死，而山楂酸能减少肾细胞凋亡及坏死数量。

Ramesh等[11]的研究结果显示，氧化性损伤可能是顺铂引起肾功能损伤的主要原因，而氧化应激反应及在氧化过程中产生的多种代谢产物，可直接损伤细胞核酸、蛋白质、黏多糖和脂类物质，并通过多种途径激活细胞内凋亡信号转导通路，引起组织细胞凋亡，从而导致有功能的肾小管细胞、肾小球和肾实质细胞损害和坏死，导致肾功能短时间内急剧衰退，表现为急性肾功能损害。山楂酸具有良好的抗氧化作用，能抑制由羟基自由基诱导的肝细胞膜和血浆中脂质过氧化，且对脂多糖诱导产生的一氧化氮(NO)有强烈抑制作用。可见，山楂酸可能主要通过其良好的抗氧化作用起到改善顺铂对肾脏细胞的损害作用。

综上所述，山楂酸对顺铂所致HK－2细胞毒性有防护作用，有望成为顺铂所致肾毒性的治疗药物。但本研究并未深入研究其确切机制，尚待进一步探讨。

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Effect of M aslinic Acid on Cisp latin－Induced Nephrotoxicity

Ouyang Zizhang1，Zhu Shaohua2，Wu Shuhong3，Liu Xiaoping1，Chang Huili1，Mai Lusi1，Xiao Chengyin1
（1.The Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Qingyuan，Guangdong，China 511515； 2.School of Pharmacy，Zhongshan University，Guangzhou，Guangdong，China 510006； 3.Maternal and Child Health Care Hospital of Qingyuan City，Qingyuan，Guangdong，China 511500）

Objective To investigate the effect of maslinic acid on Cisplatin－induced toxicity in kidney injury.M ethods Renal tubular epithelial（HK－2）cells were selected.The experiment was divided into four groups：control group，Cisplatin group，maslinic acid protection group（maslinic acid＋Cisplatin），Vitamin E protection group（Vitamin E ＋ Cisplatin）.MTT was used to assess the viability of cell.Lactate dehydrogenase（LDH）was assessed to evaluate the kidney injury.Hochest 33342／PI was applied to determine the apoptosisof cell.Results After treatment of Cisplatin to HK－2 cell for 24 h，the viability of cell was significantly decreased，the release of LDH was increased，and the apoptosis of HK－2 cell was observed.However，when pretreatment of either maslinic acid or Vitamin E，the viability of cell was increased obviously，the release of LDH was decreased and the apoptosis of cell was decreased.Conclusion In HK－2 cells experiments，maslinic acid has protective effects on Cisplatin－induced toxicity.

maslinic acid；Cisplatin；kidney injury；lactate dehydrogenase

R285.5；R282.71；R979.1

：A

：1006－4931(2017)12－0007－04

2017－03－10；

2017－03－28)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.12.002

广东省清远市科技计划项目[2012B011204020]。

欧阳资章（1973－），汉族，博士研究生，副主任药师，研究方向为药物毒理学，（电子信箱）oyzz8100＠126.com。