鸡蛋溶血巴斯德菌药敏试验及氨基酸代谢研究

魏 超,周 虹，郭灵安，代晓航，刘 炜

(四川省农业科学院分析测试中心, 四川 成都 610066)



鸡蛋溶血巴斯德菌药敏试验及氨基酸代谢研究

魏 超,周 虹，郭灵安，代晓航，刘 炜

(四川省农业科学院分析测试中心, 四川 成都 610066)

【目的】探讨鸡蛋中溶血性微生物进来源及生物安全性。【方法】采用特异性培养基在鸡蛋中分离一株溶血性微生物，对其进行生化鉴定、16SrDNA进行测序并聚类分析，采用7类9种抗生素抗性试验对溶血微生物进行药敏试验，对其进行发酵底物蛋白质和游离氨基酸研究。【结果】生化鉴定与16rDNA鉴定分离的溶血性微生为溶血巴斯德菌，药敏试验结果表明氨基糖苷类抗生素对此菌有一定的抑制作用，但青霉素钠、罗红霉素和喹诺酮类抗生素环丙沙星对此菌无抑制效果，底物发酵实验结果为溶血巴斯德菌的代谢对蛋白质总量影响不大，但可升高发酵培养基中部分游离氨基酸的含量。【结论】鸡蛋中存在非常见致病微生物的污染，并且部分抗生素对致病微生物已无抑制作用，鸡蛋中的微生物可以改变底物结构，相关部门应加强对新鲜鸡蛋微生物污染的控制，关注罕见致病菌及条件致病菌引起的危害。

溶血巴斯德菌；16SrDNA；药敏试验；氨基酸及蛋白质代谢

【研究意义】在鸡蛋存偶尔会爆发多种致病微生物的感染，为其食用安全埋下隐患，本实验在鸡蛋中发现溶血性微生物，对其进行鉴定、耐药试验和代谢分析旨在对其安全食用及卫生防控提供依据。【前人研究进展】溶血巴斯德杆菌(Pasteurellahaemolytica)属于巴斯德菌属(Pasteurella) ，是一种革兰氏阴性，无动力，无芽孢的短杆或球杆菌，是存在于牛、绵羊、山羊等反刍动物以及其他多种动物上呼吸道的常在菌和机会致病菌[1-2]。由巴斯德氏菌属引起的感染性疾病中，以出血败血性巴斯德氏菌所致者较多见，溶血性巴斯德氏菌和其他巴斯德氏菌很少引起人类疾病，但溶血性巴斯德氏菌感染人体后症状大多表现较重[3-5]。我国已报道多例鸡、鸭、鹅等家禽感染此菌患病的案例[6-8]，但在蛋中检测出溶血巴斯德杆菌还未有报道。【本研究切入点】本实验在鸡蛋中分离一株溶血巴斯德杆菌，经生化鉴定为溶血曼海姆菌或溶血巴斯德菌，对此株微生物进行16SrDNA进行测序并聚类分析，此菌与巴斯德菌同源性为100 %与曼海姆菌同源性为94 %，因而判定为溶血巴斯德菌，对其进行药敏试验和氨基酸变化分析，为研究微生物的耐药性和生物代谢提供理论依据。【拟解决的关键问题】对鸡蛋中溶血性微生物的研究旨在研究微生物对鸡蛋食用安全及后游产业的影响，其结果将为该类条件致病菌的研究提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 鸡蛋(成都市某超市)。

1.1.2 仪器与试剂 微生物生化鉴定：法国生物梅里埃公ATB细菌鉴定仪，试剂条ID 32 E，微生物培养纯化所用培养基为广东环凯。

抗生素药敏片：氯霉素，复方新诺明，罗红霉素，链霉素，环丙沙星，庆大霉素，卡那霉素青霉素，土霉素，氯霉素，复方新诺明，庆大霉素，卡那霉素(Oxoid公司，Ф6mm)

蛋白质测定采用kjetltec 2400全自动凯氏定氮仪。氨基酸测定采用S433D氨基酸分析仪德国sykam(赛卡姆)。

分子生物学鉴定试剂 MasterMix 购于成都博瑞克生物技术有限公司; 引物为微生物16SrDNA通用引物27f，1492r 由上海英骏生物技术公司合成，测序为上海立菲生物技术有限公司。

1.2 分离鉴定

鸡蛋样品均质后，取25 g于无菌均质袋中，加入225 mL缓冲蛋白质水，拍击30 min ，36 ℃培养18 h，增菌液划线血平板36 ℃培养24 h，培养基观察菌落特征。

对典型溶血微生物血平板进行纯化扩菌，挑取血平板上纯化菌落至比浊管，振荡分散，调至0.5麦氏浊度，装填ID 32 E试剂条，由ATB系统自动检测、数据分析并给出最终结果。

1.3 微生物的分子鉴定

采用25 μl反应体系, 反应体系为MasterMix 12.5 μl; 27f和1492r 引物各1 μl、模板DNA 1 μl、加ddH2O 至25 μl。反应条件为: 预变性95 ℃ 5 m in；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共进行35个循环；72 ℃ 7 min。电泳结果进行分析，PCR产物直接测序，测序结果采用DNAMAN,MEGA6.0软件进行处理分析。

1.4 抗生素抗性试验

纯菌菌落在生理盐水中制成0.5个麦氏混悬液，取1 mL于空白培养皿中，倾注15 g营养琼脂进行混菌，待培养基凝固后用药敏纸贴于培养基表面，(36±1) ℃倒置培养24～48 h。

1.5 发酵液蛋白质及氨基酸含量的测定

纯菌菌落在生理盐水中制成0.5个麦氏混悬液，分别取1 mL接种于培养基BHI和5 %鸡蛋液的BHI培养基，36 ℃漩涡震荡培养24 h。

称取2.5 g发酵液于凯氏定氮仪测定含氮量，用公式蛋白质含量(g)=氮(g)×6.25计算发酵液中蛋白质的百分含量。

称取发酵液1.0 g于磺基水杨酸沉淀蛋白质，发酵液经滤纸过滤后，水浴锅上挥发为干物质，采用0.02 mol/mL盐酸水溶液1 mL进行复溶解后进样测定游离氨基酸含量，未接种培养基为空白对照。

2 结果与分析

2.1 菌落形态及生化鉴定

此株细菌在血平板上培养24 h后菌落特征为菌落浅灰色、光滑湿润，有明显β溶血圈，氧化酶试验阳性；革兰氏染色镜检结果为G-球杆菌。ATB生化鉴定分析结果见表1，其ID %为95.3，T值(表示其生化反应结果与该菌最典型生化谱的接近程度，ID值为待检菌在整个数据库中应属于哪个分类单位)为0.58，判定为溶血满海姆菌或溶血巴斯德菌，评语为好的鉴定。

2.2 分子鉴定

由于微生物生化全自动鉴定系统给此株微生物双结果鉴定，所以利用微生物16SrDNA鉴定方法对此株微生物进行辅助鉴定，采用通用引物27f(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492r(5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3)对其16SrDNA进行扩增测序，其测序结果编号为W2014-7-1285，在GENEBANK上下载编号分别为：AY O78998.1、AY 362926.1、AY 507116.1、JF 706218.1、NR 024897.1、NR 024899.1、NR 1144448.1 3组曼海姆菌(Mannheimia)和4组巴斯德菌(Pasteurella)典型序列与其进行同源性聚类分析，分析图谱见图1，由图1可以看出，分离微生物与巴斯德菌株同源性98 %～100 %，与曼海姆菌的同源性94 %～97 %，且巴斯德菌同属不同种之间同源性较高，可以判定此株微生物为溶血性巴斯德菌。

表1 溶血巴斯德菌生化鉴定

注：“-”表示阴性，“+”表示阳性。

Note：‘-’means negative, ‘+’ means positive.

图1 溶血巴斯德菌同源树Fig.1 Homology tree of Pasteurella haemolytica

2.2 药敏试验

采用9种人用或兽用常见抗生素进行药敏试验，其中氨基糖甙类抗生素采用卡那霉素、链霉素、庆大霉素；β-内酰胺类抗生素采用青霉素钠；大环内酯类抗生素采用罗红霉素；磺胺类抗生素采用复方新诺明；四环素类抗生素采用土霉素；氯霉素类抗生素采用氯霉素，喹诺酮类抗生素采用环丙沙星。按照药敏试验抗性标准抑菌圈直径(毫米)判定敏感度：0为不敏，10以下为低敏，10～14为中敏，15～20为高敏，20以上为极敏(表2)。β内酰胺类抗生素青霉素钠、大环内酯类抗生素罗红霉素、喹诺酮类抗生素环丙沙星对溶血巴斯德菌均无抑制作用，微生物对几种氨基糖甙类抗生素极敏，对复方新诺明和氯霉素也表现极敏。

2.3 溶血巴斯德菌发酵液蛋白质及氨基酸代谢

蛋白质测定总含量(表3)略有降低但减低幅度不大，即微生物的发酵不会影响整体底物蛋白质的总含量。在蛋白质总含量差异不大的条件下进行游离氨基酸测定，添加蛋液和非添加蛋液的两种发酵培养条件下游离氨基酸的含量普遍略有升高(图2，表4)，但其中精氨酸(ARG)和丝氨酸(SER)含量有所降低，对γ-氨基丁酸(γ-Aba)测定也出现发酵液中的含量降低，表明微生物发育过程中会利用培养基中的这3种氨基酸。溶血巴斯德菌会微量改变底物的物质结构，利用部分必须氨基供自身生长繁殖同时也释放或改变一些氨基酸组份。

表2 溶血巴斯德菌药敏试验

表3 溶血巴斯德菌发酵液蛋白质含量

3 讨 论

3.1 溶血巴斯德菌的鉴定

本实验生化检测采用的是梅里埃的全自动鉴定系统，试剂条为ID 32E ,虽然进行了32个生化反应，且鉴定结果评价为好，但还是出现双结果鉴定，由于溶血性曼氏杆菌和性巴氏杆菌在形态大小、染色特性等方面较相似，从而为这两种细菌的准确鉴定造成不便。溶血巴斯德菌和溶血曼海姆菌都是牛羊等反刍动物致病菌之一，并且两种菌经常同时侵染个体，两者同时检出并难以区别。本实验对鸡蛋中分离微生物进行16SrDNA测序，并与GENEBANK下载巴斯德菌和曼海姆菌进行同源分析，不同种巴斯德菌16SrDNA相对保守且与曼海姆菌16SrDNA有一定差异，可见分子生物学方法可以将2种不同属微生物分开，建立一种可以同时快速、准确检测和鉴定溶血性曼氏杆菌和溶血巴氏杆菌的方法具有重要的应用价值。

3.2 溶血巴斯德菌的致病性

从鸡蛋中分离的溶血性巴斯德菌在血平板上有较明显的β溶血现象，溶血性多为病原微生物所产生的毒素类物质而导致机体红细胞及其他有核细胞裂解。巴斯德氏菌属引起感染性疾病中，以出血败血性巴斯德氏菌所致者较多见，溶血性巴斯德氏菌很少引起人类疾病，但溶血性巴斯德氏菌感染后症状大多表现较重。溶血巴斯德杆菌主要有4种毒力因子:菌毛、多糖荚膜、内毒素(LPS)及白细胞毒素(LKT)，致毒因子的含量与比例也与培养基底物氨基酸含量有一定关系。药敏试验表明，此株溶血巴斯德菌对多种抗生素产生抗性，这与日常抗生素类药物滥用不无关系。

图2 氨基酸分析图谱Fig.2 AA analysis graph

氨基酸种类BHI培养基5%蛋液+BHI培养基游离氨基酸(mg/100g)游离氨基酸空白对照(mg/100g)游离氨基酸(mg/100g)游离氨基酸空白对照(mg/100g)ASP0.4080.3710.3400.333THR0.3000.2840.0610.304SER0.1230.3610.1040.106GLU0.7530.7040.7340.636GLY0.3540.3160.3450.309ALA0.5810.5600.7000.557CYS0.1770.1700.6290.141VAL0.3680.3630.4210.392MET0.3290.3050.3240.290ILE0.3040.2910.3250.317LEU0.9541.0020.8560.967TYR0.3200.3180.3300.299PHE0.4850.0220.5010.431HIS0.5370.5050.5790.616LYS0.7110.7300.7370.676ARG0.9681.0270.2700.861PRO0.00270.00240.1040.093合计7.6747.3317.3607.328γ-Aba0.0270.0210.0300.020

4 结 论

鸡蛋中分离的溶血巴斯德菌有溶血性，且对多种抗生素耐药，且可改变底物氨基酸组成结构对鸡蛋的营养成分和生物安全埋下隐患。我国已报道多例鸡、鸭、鹅等家禽感染此菌患病的案例，在鸡蛋中还是首次检出，在鸡蛋的日常食用过程中，多以煎煮等加工熟食为主，但某些家庭喜好未完全煮熟的“糖心蛋”，这些为鸡蛋的食用安全埋下隐患。因此，应加强对新鲜鸡蛋微生物污染的控制，严格动物的饲养管理，除了检测常规致病性微生物外，也应该多关注罕见致病菌及条件致病菌，为研究、发现及控制做好数据储备工作。

[1]Hiraku Sasaki, Eiichi Kawamoto, et al. Comparative analysis of Pasteurella pneumotropica isolates from laboratory mice and rats[J]. Antonie van Leeuwenhoek,2009,95:311-317.

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(责任编辑 李 洁)

Study on Susceptibility Testing and Amino Acid Metabolism ofPasteurellahaemolyticain Eg

WEI Chao, ZHOU Hong, GUO Ling-an, DAI Xiao-hang, LIU Wei

(Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066,Chian)

【Objective】The study aims to explore the origin and biosafety of hemolytic microorganisms in eggs. 【Method】Isolated from the eggs by specific culture medium, a hemolytic microorganism was biochemically identified, and 16SrDNA sequencing and cluster analysis was also conducted on it. Resistance tests of seven kinds of and nine species of antibiotics were used to carry out the susceptibility testing of the hemolytic microorganism, and the proteins and free amino acids in the fermentation substrate were studied. 【Result】The isolated hemolytic microorganism was identified as Mannheimia haemolytica or Pasteurella haemolytica by biochemical identification and 16SrDNA identification. The results of susceptibility testing showed that except aminoglycosides, penicillin of β-lactams antibiotics, roxithromycin of macrolides antibiotics and Ciprofloxacin of 4-quinolones antibiotics had no inhibitory effect on the microorganism. The experimental results of fermentation substrate show that metabolism of hemolytic Pasteurella haemolytica has little effect on the total protein amount, however, it can increase the content of some free amino acids. 【Conclusion】There are non-common pathogenic microorganisms in the eggs, on which some antibiotics have no inhibitory effect and the microorganisms can change the structure of the substrate. Therefore, the relevant departments should strengthen the control of microbial contamination of fresh eggs and pay close attention to the hazards caused by non-common pathogenic microorganisms and conditional pathogenic microorganisms.

Pasteurellahaemolytica；16SrDNA；Susceptibility test; AA and protein metabolism

1001-4829(2017)6-1335-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.017

2016-06-13

国家农产品质量安全风险评估重大专项(GJFP201 601302)

魏 超(1985-)，女，助理研究员，硕士研究生，主要从事食品农产品微生物检测及相关风险评估，E-mail：cc123qqq@163.com。

S858.31

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